FBA

Dra Virginia Mariani - Endocrinología
Standard de referencia
para inmunoensayos
Duboscq C, Kordich L - Subprograma de Hemostasia - PEEC

Preparaciones internacionales de referencia (IRP):

Se se ha demostrado que muchas hormonas polipeptídicas existen en el plasma en una variedad de formas, por ej. Glucagón de páncreas e intestino, proinsulina e insulina. Además varias hormonas glicoproteicas contienen la misma subunidad alfa, por ej. STH y hormona lactógeno placentaria, LH, FSH, TSH y hCG; de ahí que el RIA de hormonas polipeptídicas en plasma pueden sufrir cruzamiento en el caso de una mezcla de componentes con estructuras relacionadas o parcialmente idénticas. Por lo tanto los sistemas de ensayo deben ser capaces de producir resultados cuantitativos que puedan ser interceptados o reproducidos en otros laboratorios.
Aquí se ve la importancia del standard, que en el caso de hormonas polipeptídicas es obtenido de distinta forma, o bien proviene de distintas fuentes y por lo tanto los lotes difieren entre sí aun en las mejores preparaciones. En ese caso se necesitan contar con un patrón de referencia internacional, cosa que se evita si la sustancia a dosar se puede obtener como un compuesto puro caracterizado física y químicamente. La diferencia entre los lotes puede deberse a: presencia de enzimas proteolíticas, pérdida de carbohidratos de hormonas glicoproteicas, distintos métodos de conservación. Además si los péptidos son sintéticos, puede haber error en la cadena de aminoácidos. Se disponen en algunos casos de preparaciones internacionales de referencia internacional, IRP, que provienen del National Institute or Biological Standards and Controls de Gran Bretaña (NIBSC) y de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para usar como standards, y es usual que distintas organizaciones colaboren internacionalmente en la producción, calibración y distribución de las sustancias que son conocidas como IRP. Se requiere este tipo de preparación ya que muchos materiales biológicos no pueden ser caracterizados como una única sustancia químicamente definida. En general comprenden macromoléculas complejas, proteínas u otros materiales biológicos que han sido fraccionados o parcialmente purificados. Hay que tener en cuenta que estos standards están definidos respecto a una respuesta biológica en un sistema de ensayo particular y que por lo tanto están dados en unidades de bioactividad, a pesar de que el RIA mide inmunoreactividad. Sin embargo si siempre se utiliza la misma preparación de referencia para calibrar el ensayo, los resultados estarán expresados en unidades internacionales / unidad de volumen, lo cual dará una referencia arbitraria para evaluar y comparar resultados de inmunoensayos propios o entre laboratorios.

Sustancias químicamente puras (Pure Chemicals)

Sustancias con pesos moleculares por debajo de 5000 daltons, pueden ser purificadas para obtener un compuesto único con estructura química definida. Esto es raro en macromoléculas biológicas donde existen pequeñas diferencias en cargas o grupos químicos, entre moléculas de la misma especie química. Como ej. de sustancias puras se puede citar T3, T4, esteroides.

Solventes: Para diluir los standards se debe utilizar preferentemente un solvente que sea lo más parecido posible al solvente de la muestra a dosar para equiparar las condiciones del análisis, por ejemplo suero o plasma, orina u homogenato de tejido libre del analito a dosar. Si esto no fuera posible se utiliza una solución buffer conteniendo una proteína como ser albúmina o gelatina para dar un medio de reacción similar al suero o plasma. Hay que tener en cuenta que no siempre se puede usar albúmina en el buffer ya que a veces esta proteína es usada como carrier y el antisuero cruzaría en parte con ella. Si bien las muestras liofilizadas se reconstituyen con agua destilada hay que tener en cuenta que el liofilizado ya contiene proteínas o bien es suero.

1- Suero libre de analito: Si bien se dispone de suero o plasma normal se hace necesario separar el analito endógeno. Para ello se utilizan métodos como absorción fina con carbón, resinas talco o sílice, si bien son más específicos los métodos de inmunoadsorción. En este último método, el anticuerpo que servirá para separar el analito endógeno está unido a una fase sólida y esta última puede actuar como un gel de filtración que adsorbe iones y proteínas. La principal dificultad en este método es asegurarse que no quede en el suero cantidades significativas de antisuero libre lo cual alteraría los resultados del inmunoensayo. Si la contaminación es muy grosera, se detecta por la cantidad de antígeno marcado que une, pero si existen bajas concentraciones es difícil de detectar. Los métodos de adsorción física requieren controles muy estrictos y de ser posible, deben ser repurificados. A veces es posible obtener suero libre de analito en cantidades limitadas por medio de manipulaciones fisiológicas de la hormona en voluntarios. Por ejemplo se pueden suprimir las secreciones hipofisarias de ACTH o TSH inyectando dexametasona o T4 respectivamente para obtener sueros con concentraciones no detectables de Cortisol en el primer caso o de TSH en el segundo caso.

2- Validación del solvente a usar: Si se usa adsorción física, hay que tener en cuenta que se extraen otros tipos de compuestos además de la sustancia en cuestión por lo tanto hay que determinar la concentración proteica antes y después de la extracción, así también como albúmina, gama globulina, proteínas ligantes de hormonas (si las hubiera), cloruros, fosfatos, u otros iones, para asegurarse que la fuerza iónica y la composición proteica no difiere mucho del suero normal. Si el standard de referencia se disuelve en buffer, se testea una serie de muestras diluidas con el primer buffer y se compara con el standard para ver si existe paralelismo.

• Preparación de las soluciones de standard de referencia:
Se debe usar material volumétrico preciso y recientemente calibrado. El volumen a medir no debe ser excesivamente pequeño ya que el error sería grande. Es usual preparar el standard de referencia a una concentración mayor que la máxima concentración a usar en el ensayo ya que se comprueba que la estabilidad a concentraciones altas es mayor.

• Almacenamiento de standard de referencia:
Se fraccionan en pequeñas alícuotas para facilitar su uso y para evitar el congelamiento y descongelamiento sucesivo que daña el material. Las condiciones de almacenamiento dependen de la estabilidad del material. Usualmente se congela a – 20 grados C si bien a veces se hace necesario hacerlo a – 80 grados C

• Calibración de los standard de trabajo:
Los standard de trabajo son aquellos que se usan en la rutina del RIA y que se fabrican en cantidades mucho mayores que los standard de referencia y con técnicas menos precisas. Para calibrarlos se incorporan a los ensayos como especies desconocidas cuyos valores se obtienen por interpolación en la curva del standard de referencia. Luego una vez conocidos los valores se hacen por lo menos diez ensayos y utilizando la curva del standard de trabajo y se incluyen los pooles de control de calidad. El standard de trabajo debe abarcar los rangos clínicos críticos y se deben fijar los errores máximos permisibles para cada punto de la curva. Hay que tener en cuenta que el standard de trabajo calibrado para un determinado sistema operativo no necesariamente sirve para usar en un ensayo diferente con los mismos valores, debido a que diferentes reacciones cruzadas con el antisuero o distintos efectos del solvente de los dos sistemas de ensayo pueden producir distintos resultados.

Conclusiones:

• Existen estándares que se pueden obtener como sustancias químicamente puras, mientras que en el caso de hormonas proteicas no se puede proceder de la misma manera. Deben ser considerados como dos grupos perfectamente diferenciados.
â Los sistemas de ensayo deben ser capaces de producir resultados cuantitativos que puedan ser interpretados o reproducidos en otros laboratorios.

• Las hormonas polipeptídicas son obtenidas de diversas formas, o bien proviene de distintas fuentes y por lo tanto los lotes difieren entre si, aun en las mejores preparaciones.

• Se necesita contar con un patrón de referencia internacional, cosa que evita que la sustancia a dosar se pueda obtener como un compuesto puro caracterizada física y químicamente
n Los estándares están definidos respecto a una respuesta biológica en un sistema de ensayo particular y que por lo tanto están dados en unidades de bioactividad (unidades internacionales / unidad de volumen), a pesar de que el RIA mide inmunorreactividad.

• El estándar de trabajo calibrado para un determinado sistema operativo no necesariamente sirve para usar en un ensayo diferente con los mismos valores, debido a que diferentes reacciones cruzadas con el antisuero o distintos efectos del solvente de los dos sistemas de ensayo pueden producir distintos resultados.