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Microorganismos en busca de un ambiente favorable
Quimiotaxis y otras yerbas... PARTE I

El Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana ha seleccionado este artículo publicado en la Revista CIENCIA HOY, Volumen 18 º 105 JUNIO/JULIO 2008, para su difusión a través de FABA Informa
¿Cómo son los refinados mecanismos que les permiten a las bacterias percibir tanto su alimento como su amenaza? ¿Qué posibilidades nos ofrece la comprensión de la quimiotaxis para desarrollar tecnologías de recuperación de ambientes contaminados para promover asociaciones mutualistas entre plantas y bacterias y para prevenir procesos infecciosos?

Karina Herrera Seitz y Claudia Studdert
Instituto de Investigaciones Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,Universidad Nacional de Mar del Plata

Muchos microorganismos están dotados de un sistema de percepción de exquisita sensibilidad que les permite detectar nutrientes, oxígeno, luz, calor y otros factores fisico-químicos de los alrededores y dirigirse activamente hacia zonas más favorables para su crecimiento. Esta característica resulta fundamental para la supervivencia en ambientes heterogéneos y cambiantes. Además, representa un campo con potenciales aplicaciones biotecnológicas.
Las bacterias son organismos constituidos por una única célula cuya complejidad es mucho menor que la de los organismos superiores. Sin embargo, han desarrollado múltiples sistemas de percepción que les permiten detectar las condiciones del ambiente que las rodean y responder adecuadamente. Uno de tales sistemas es el que gobierna la quimiotaxis, o capacidad para percibir gradientes de concentración de sustancias químicas y dirigir su movimiento hacia zonas más favorables. Diversos tipos de bacterias son capaces de ‘oler’ sus nutrientes preferidos y acercarse a ellos, así como evitar sustancias tóxicas nadando activamente en dirección opuesta. En modo similar, algunas bacterias perciben otros estímulos como la luz, la temperatura o el magnetismo y adecuan su movimiento para ubicarse con respecto a estos.

El comportamiento quimiotáctico fue descripto por primera vez por Theodor Engelmann y Wilhelm Pfeffer a fines del siglo XIX, y estudiado meticulosamente hasta dilucidar sus detalles moleculares durante los últimos cuarenta años.

La sensibilidad del sistema de percepción y la velocidad con que se produce la respuesta motriz permite compararlo con el sistema nervioso de los animales, ya que la información proveniente del estímulo es procesada rápidamente y transformada en una orden para el aparato de locomoción.
En este artículo describiremos a grandes rasgos cómo las bacterias exploran el medio y buscan así el ambiente más adecuado para su desarrollo, cuáles son los mecanismos moleculares responsables de este comportamiento y sus implicancias ecológicas.



Figura 2
. Bacterias provistas de flagelos moviéndose desde una zona de menor hacia una de mayor concentración de una sustancia atrayente.

Bacterias exploradoras
Imaginemos a una persona perdida en el centro de una inmensa cuadrícula, compuesta de largos pasillos perpendiculares entre sí con salidas hacia los costados y paredes ciegas dispuestas caprichosamente. Esta persona empezará a recorrer el laberíntico espacio en busca de posibles fuentes de alimento y, entonces, caminará al azar, cambiando de rumbo sin ningún sentido con la esperanza de descubrir alguna pista. Sin embargo, si por casualidad percibe cierto aroma que parece provenir de carne asada, comenzará a tratar de elegir el camino que la lleve hacia allí y reducirá los cambios de dirección al mínimo posible. Del mismo modo, si en su recorrido toma una elección que la acerca a un olor desagradable, probará salidas alternativas con el fin de alejarse de ese sitio, e intentará mantener un rumbo que la aleje de lo que percibe como nocivo.
En forma parecida a la de esta persona hipotética, las bacterias describen, en un medio uniforme, un movimiento al azar en tres dimensiones, determinado por una cierta frecuencia de cambios de dirección. Sin embargo, si su sistema de percepción les indica que se están acercando a un lugar más favorable (por ejemplo, con mayor concentración de nutrientes), ese estímulo envía un mensaje a los flagelos, que comandan el movimiento, para que disminuyan los cambios de rumbo; si, por el contrario, percibe que se está acercando a un lugar con mayor concentración de una sustancia tóxica, el sistema sensorial envía una señal a los flagelos para que se incrementen los cambios de camino, y así la bacteria prueba rápidamente muchos rumbos posibles hasta que encuentra aquél que identifica como correcto.
Llamaremos excitación al proceso por el cual la bacteria percibe el gradiente (variación en el ‘olor’ de una sustancia) y responde con un cambio en la frecuencia de cambios de dirección.
Figura 1. Escherichia coli, una de las bacterias que habita en el tracto intestinal de humanos. Imagen amplificada 10.000 veces. Micrografía electrónica de baja temperatura.
Foto: Eric Erbe, Coloreado digital Christopher Pooley.
Fuente: Wikipedia Commons
Ahora, sigamos imaginando a la persona en busca de su almuerzo... Si una vez elegido su rumbo esta persona continúa caminando y descubre que la intensidad del aroma agradable se mantiene constante, hará nuevas pruebas con la intención de encontrar el camino que la lleve al asado. Incrementará nuevamente los cambios de dirección, y sólo continuará en un sentido determinado cuando su nariz le indique que la intensidad del aroma va en aumento.
Del mismo modo actúan las bacterias que detectaron un aumento en la cantidad de nutrientes y, en consecuencia, suprimieron sus cambios de dirección. Cuando encuentran que ese nuevo ambiente es uniforme, al cabo de cierto tiempo recuperan la frecuencia inicial con la que probaban nuevos rumbos.
Llamaremos adaptación al proceso por el cual la bacteria recupera la frecuencia inicial de cambios al detectar que el nuevo ambiente es uniforme. Este proceso determina la capacidad de respuesta a cambios de concentración de las sustancias en un amplio rango de concentraciones, ya que ‘anula’ la respuesta cuando el estímulo no varía y deja al organismo preparado para responder a un nuevo cambio.

Herramientas y mecanismos
El sistema de quimiotaxis que posee Escherichia coli, una de las bacterias que habita nuestro tracto intestinal, es uno de los más estudiados. Escherichia coli tiene varios flagelos dispuestos alrededor del cuerpo celular (ver figura 2), que pueden girar hacia uno u otro lado movidos por pequeños motores. El combustible de estos motores es un gradiente en la concentración de iones de hidrógeno a ambos lados de la membrana celular generado por la propia respiración de la célula.
Cuando los flagelos se mueven en un sentido forman un haz que propulsa la bacteria hacia adelante. Cuando giran en la dirección opuesta, el haz de flagelos se desarma y como consecuencia la célula experimenta un cambio brusco de dirección o ‘tumbo’ (ver ‘Respuesta motriz’ en recuadro ‘Mirada en detalle a los mecanismos moleculares’).
En un ambiente uniforme, las bacterias nadan y dan tumbos alternadamente y ello determina un movimiento en tres dimensiones sin dirección neta. Si detectan un aumento en la concentración de una sustancia atrayente, los tumbos disminuyen y se produce un desplazamiento neto en la dirección favorable, mientras que si la concentración de atrayente disminuye o se incrementa la concentración de una sustancia repelente, la frecuencia de tumbos aumenta y también la probabilidad de encontrar la dirección que las aleje del estímulo desfavorable. Ambas respuestas son transitorias y desaparecen tras el período de adaptación, lo que permite la detección de un nuevo estímulo.
En muchas otras bacterias el control de la frecuencia de cambios de dirección ocurre de manera un poco diferente. En algunos casos lo que se controla es la velocidad de rotación, en otros la frecuencia con la que la rotación se detiene, y otros presentan un sistema similar al de E. coli. Otras bacterias carecen de flagelos pero se desplazan sobre superficies utilizando otro tipo de apéndices o secretando sustancias mucosas, y en cualquier caso pueden dirigir su movimiento neto frente a los estímulos ambientales. Sin embargo, el sistema de señalización utilizado por bacterias muy diversas, evolutivamente distantes y morfológicamente diferentes, es muy similar y comparte proteínas cuyo grado de similitud indica la aparición de ese sistema en un organismo ancestral que dio origen a las distintas especies de bacterias. Con el tiempo, la evolución fue modelando a cada especie para llegar a las diferentes versiones actuales, que verdaderamente lucen como variaciones sobre un mismo tema.
Muchos de los métodos utilizados para estudiar el fenómeno de quimiotaxis en el laboratorio son sorprendentemente sencillos y se basan en la visualización de la acumulación de bacterias en respuesta a un gradiente en la concentración de atrayentes, que puede ser generado por los propios microorganismos o creado de forma artificial (ver recuadro ‘Sencillez para observar la complejidad’).

UNA MIRADA EN DETALLE A LOS MECANISMOS MOLECULARES

Entrada y procesamiento de la señal
Los receptores, proteínas inmersas en la membrana celular, están expuestos por un lado a la interacción con los potenciales ligandos (rombos verdes) y por el otro en contacto con las proteínas de señalización (hacia el interior de la célula).
El módulo central es un complejo ternario compuesto por los receptores (representados en grupos de a tres compuestos por receptores de la misma o distinta especificidad), la proteína acopladora CheW (círculos azules) y la proteína CheA (representada como la forma rojo/naranja asociada a los círculos azules).
Este complejo se encuentra en equilibrio entre un estado “activo”, que promueve la autofosforilación de CheA y la transferencia del grupo fosfato (P) a la proteína CheY (semicírculos amarillos), y un estado “inactivo” incapaz de promover esa transferencia de fosfato.
La unión de sustancias atrayentes (en general nutrientes) a los receptores desplaza el equilibrio hacia la forma inactiva, mientras que la unión de sustancias repelentes (en general sustancias tóxicas para la célula) lo desplaza hacia la forma activa.

RESPUESTA MOTRIZ
En ausencia de las proteínas de señalización, o en respuesta a atrayentes, los siete u ocho flagelos que se encuentran alrededor del cuerpo de la bacteria rotan en el sentido contrario al de las agujas del reloj y forman así un haz que propulsa la bacteria hacia adelante (izquierda).
La proteína CheY en su estado fosforilado (CheY-P) interactúa con el “interruptor” situado en la base del motor flagelar y determina que la rotación del flagelo proceda en dirección opuesta.
Esto causa una desorganización momentánea del haz de flagelos y entonces la bacteria experimenta un cambio brusco de dirección o “tumbo” (derecha).
La concentración de CheY -P determina entonces la frecuencia con la que se producen cambios de dirección.
La presencia de una fosfatasa llamada CheZ, que remueve el grupo fosfato de CheY-P, asegura una rápida desaparición de la señal a menos que ésta se genere en forma constante por la actividad de CheA.
SENCILLEZ PARA OBSERVAR LA COMPLEJIDAD
A) Ensayos independientes del metabolismo
En estos ensayos se puede observar quimiotaxis hacia un gradiente químico que se forma por difusión de la sustancia contenida en tapones o capilares hacia el medio circundante. No se requiere que las bacterias metabolicen el compuesto ya que el gradiente se genera por difusión.



Ensayo de capilares
Pequeñísimos tubos capilares (1 a 10 ?l de volumen interno) se llenan con la sustancia atrayente contenida en un soporte sólido (agar) y se sumergen en una cámara que contiene una suspensión de bacterias. El atrayente difunde hacia el medio y las bacterias quimiotácticas nadan hacia él y se acumulan alrededor de la boca del capilar, observándose una “nube” blanquecina. La acumulación de bacterias alrededor del capilar con atrayente puede observarse al microscopio o aun a simple vista si las bacterias son suficientemente móviles. Este ensayo puede hacerse cuantitativo si se permite que las células se introduzcan en el interior del capilar con atrayente y luego se cuentan. En la misma cámara se puede incluir más de un capilar con diferentes sustancias a evaluar o sin atrayente, y luego compararlos.
Tapones de agarosa
En este caso la sustancia atrayente o la solución control están incluidas en una gota que contiene un gelificante (agarosa o agar) que luego queda sumergido en una suspensión celular. Las gotas o tapones se colocan sobre un portaobjetos y se tapan con un cubreobjetos.
En la cámara que se forma entre el porta y el cubre se coloca la suspensión celular, y las bacterias se ubican en la zona donde la concentración de atrayente es óptima.
El resultado puede verse a simple vista. En la misma cámara pueden compararse distintos atrayentes.
Este mismo ensayo puede hacerse mezclando agar blando con la suspensión celular. De esta manera se hace un poco más lento el movimiento de las bacterias.

B) Ensayo dependiente de metabolismo en placas de agar blando
Para este ensayo se requiere que las bacterias puedan usar la sustancia atrayente como alimento.
Se siembran las bacterias sobre un medio de agar blando que contiene el atrayente. A medida que este es consumido, las células buscan zonas con mayor concentración nadando sincronizadamente y formando un anillo detectable a simple vista y que, con el tiempo, se extiende hasta los bordes de la placa. En medios complejos se observan varios anillos originados por el consumo secuencial de los diferentes atrayentes presentes.

Existen además varios otros métodos utilizados para detectar quimiotaxis, algunos de ellos bastante sofisticados o que requieren equipamiento especial. Algunos de éstos incluyen ensayos de dos cámaras, seguimiento automatizado de células individuales al microscopio, o estimulación temporal de células.

 

Quimiotaxis y otras yerbas... PARTE I



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