FBA

Carga Viral
Seguimiento de la infección por VIH-1: Recientes avances
en la determinación de la carga viral, las nuevas técnicas
de amplificación y detección en tiempo real.

Fernando Raibenberg Asesor Programa
CV VIH-1 PEEC Fernando Raibenberg Asesor Programa
CV VIH-1 PEEC fraiben@fibertel.com.ar

La determinación cuantitativa del nivel de virus VIH-1 en el plasma ha contribuido enormemente en el entendimiento del proceso por el cual la infección viral progresa en la enfermedad y ha demostrado ser un parámetro esencial en la prognosis y manejo de los individuos infectados.
Las decisiones concernientes al inicio o cambios en la terapia antiretroviral
se rigen monitoreando los niveles de VIH-1 o carga viral, conteo CD4, junto
a la condición clínica del paciente. El objetivo de la TARV es reducir los niveles del VIH-1 en el plasma a valores no detectables (1).
Un importante avance en el diagnostico y seguimiento de la carga viral
de VIH-1 es la implementación de la detección en tiempo real
de los productos de amplificación acumulados durante la fase exponencial
de la reacción de PCR o de la misma forma de NASBA (2).
PCR en tiempo real es una modificación del proceso original de PCR tradicional. Se denomina reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (“real time PCR”) debido a que el ADN amplificado es detectado efectivamente durante la reacción. Esto asegura una cuantificación más eficaz y precisa.
La habilidad para monitorear el progreso de la reacción de PCR en tiempo real ha revolucionado la manera de enfocar los métodos de cuantificación de ADN y ARN basados en PCR. La comunidad científica, médica y diagnostica cuenta ahora con una nueva y efectiva metodología para cuantificar ácidos nucleicos.
Este enfoque evita las diluciones seriales de los productos de amplificación, necesarios en los métodos tradicionales de PCR de punto final, reduciendo el número de pasos, procesamiento, y riesgos de contaminación. Obteniéndose así resultados consistentes y reproducibles. Pero lo más importante de la detección en tiempo real, es el mantenimiento y mejora de la especificidad, y sensibilidad de la amplificación tradicional, sumando un rango dinámico lineal más amplio.

La metodología de PCR en tiempo real monitorea la fluorescencia emitida durante la reacción como un indicador de la producción de amplicones en cada ciclo (fase exponencial) en oposición a la detección tradicional de punto final de los métodos clásicos. Esta técnica esta basada en la detección y cuantificación de un fluoroforo emisor reportero. El ciclo donde se produce el primer incremento significativo en la cantidad de producto de PCR detectable por encima del background (CT - threshold cycle, ciclo umbral) correlaciona a la cantidad inicial de la secuencia templado blanco (3) (Figura 1). El concepto de ciclo umbral (CT) permite una cuantificación eficaz y reproducible fundamentada en la emisión de fluorescencia de una sonda especifica incluida en la reacción de PCR. Estos valores de fluorescencia son registrados durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificado en ese punto de la reacción
de amplificación (Figura 2). Cuanto mas templado blanco este presente al principio de la reacción menos ciclos serán necesarios para alcanzar el punto en el cual la señal de fluorescencia es registrada como estadísticamente significativa por encima del background. Este valor detectado en este ciclo constituye la definición de CT o ciclo umbral.

Las diferentes estrategias de detección, diseño de sondas, uso de estándares internos o externos, y sistemas informáticos de cuantificación, difieren entre los ensayos presentados, pero el principio básico de detección durante la amplificación permanece.
El producto de amplificación acumulado se monitorea y se expresa en la curva de amplificación, se grafica el incremento de la cantidad de fluorescencia detectada en cada numero de ciclo de PCR. El valor CT (ciclo umbral) se mide para las curvas de cuantificación de estándares de concentración conocida (curvas rojas) y de la muestra incógnita (curva negra).
Para calcular el nº de copias de la muestra incógnita se establece una curva
de calibración graficando el nº de copias conocido de los estándares vs.
El nº de ciclos umbral (CT). Del grafico de la curva de calibración se extrapola el nº de copias de la muestra incógnita del CT registrado en la muestra incógnita.
Existen disponibles en el mercado local dos metodologías de determinación de carga viral de VIH-1 en tiempo real, una basada en RT-PCR y la otra en NASBA. Hay una tercera pero aun no esta disponible en nuestro país.


TaqMan HIV-1 Monitor Test v1.5:
En el ensayo TaqMan HIV-1 Monitor real-time PCR
(Roche Molecular Diagnostics)
la amplificación y detección se determinan en un equipo analizador COBAS TaqMan 48. Este ensayo de RT-PCR esta dirigido a la región conservada
del gen gag de VIH-1 de manera similar al sistema Amplicor HIV-1 Monitor. Utiliza como, estándar interno de cuantificación QS, un ARN blindado
(Armored RNA) que al mismo tiempo es util para normalizar la preparación de las muestras y como control de inhibición. Como en el kit tradicional incorpora el uso de la uracil N glicosilasa Amperase más dUTP, para amplificar selectivamente la secuencia blanco, y evitar la contaminación por carry over. Debido a que la amplificación, y detección es en tiempo real las diluciones para cuantificar los productos de la reacción, y el procesamiento post PCR de punto final ya no son necesarios.
Para la amplificación por RT-PCR emplea la enzima polimerasa recombinante de Thermus Sp. Z05 (ADN-polimerasa termoestable obtenida por ingeniería genética) que en condiciones adecuadas (presencia de manganeso) tiene actividad como transcriptasa reversa y ADN polimerasa (5,6). Durante la amplificación, las sondas diseñadas hibridizan independientemente una
de la otra con sus respectivas secuencias complementarias sea la gag
de VIH-1 o la del QS, ambas presentes en la mezcla de reacción junto
a los primers específicos. El sistema utiliza para la detección específica
una sonda de hidrólisis (Taqman). La sonda oligonucleotidica esta conjugada en su extremo 3’ con un quencher fluoroforo (extintor de fluorescencia)
que absorbe la fluorescencia del fluoroforo reportero ubicado en la misma sonda en el extremo 5’.
Cuando la sonda esta intacta (hibridizada o no) la fluorescencia del fluoroforo emisor reportero, esta apagada por el quencher este fenómeno tiene lugar al recibir la energia de emisión del equipo. La energia se transfiere del fluoroforo reportero al quencher via FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) el quencher emite fluorescencia de una longitud de onda mayor ocultando la fluorescencia del reportero. Durante el ciclo de amplificación la sonda hibridizada a su secuencia blanco es hidrolisada por la actividad exonuclesa 5’-3’ de la TZ05, se separa así el fluoroforo reportero del quencher, y en consecuencia el fluoroforo reportero emite ahora a una menor longitud de onda (mas energética), y su señal es detectada por el analizador (3) (Figura 3). Durante cada ciclo de PCR consecutivo la fluorescencia se va incrementando debido a la acumulación exponencial progresiva del fluoroforo reportero libre.
El ensayo TaqMan HIV-1 test tiene un rango dinámico linear de 40-107 copias/ml (8) permitiendo analizar en un solo tipo de ensayo la cuantificación de la muestras. Amplifica los subtipos de VIH-1 del grupo M, A-H (7).

NucliSens EasyQ HIV-1 v1.1 Assay:
El test NucliSens EasyQ HIV-1 v1.1 (bioMerieux) consiste en una modificación del NASBA tradicional donde la detección de los amplicones de ARN en tiempo real se hace a través del uso de sondas de hibridizacion tipo Molecular Beacons (Faros Moleculares). La detección en tiempo real ocurre en la reacción de NASBA durante la continua producción de amplicones ARN antisense de la secuencia blanco por parte de la T7 ARN polimerasa. En la fase exponencial de la reacción los amplicones son detectados cuando las sondas Molecular Beacons hibridizan a la secuencias blanco generando la fluorescencia detectable (9,10). (Figura 4).

Molecular Beacons son sondas oligonucleotidicas que emiten fluorescencia cuando se hibridizan a una secuencia blanco de ADN o ARN. Estas sondas experimentan un cambio conformacional al aumentar la temperatura. La estructura de doble cadena del stem se desnaturaliza y la secuencia del loop queda expuesta para hibridizar con la secuencia complementaria blanco a detectar. En la sonda esta secuencia esta flanqueada por dos secuencias complementarias entre si (stem), en uno de sus extremos se encuentra un fluoroforo reportero y en el opuesto el quencher. Debido a la estructura en horquilla el fluoroforo y el quencher están sumamente próximos uno del otro, por ende la fluorescencia esta apagada por (FRET). Cuando la sonda hibridiza con la secuencia blanco mas larga, es mas estable que la estructura secundaria en el stem, entonces el fluoroforo se separa del quencher y se produce el incremento de la fluorescencia que ahora es detectable (3).
Un solo calibrador de ARN es adicionado a la muestra original. Se usan dos sondas marcadas con distintos fluoroforos que diferencian el amplicon blanco del calibrador permitiendo la cuantificación del ARN VIH-1 en la muestra original, basada en las tasas de síntesis de ARN en la fase transcripciónal.
La plataforma presenta un equipo de preparación de muestras, y un equipo de amplificación y detección en un solo tubo. Utiliza el analizador NucliSens EasyQ y la cuantificación de la carga viral VIH-1 se establece mediante el software NucliSens EasyQ Director (11). El rango dinámico lineal va de 50-3x106 IU/ml y reconoce los subtipos del grupo M A-H (12)

Real Time HIV-1 Assay
(no disponible aun en nuestro país)
El ensayo Real Time HIV-1 Assay (Abbott Laboratories) mide la amplificación en tiempo real del producto de PCR con una única sonda que posee una región doble cadena. La sonda esta marcada con un fluoroforo reportero en 5’ de una cadena y con un quencher en el extremo 3’ de la cadena complementaria (12). En presencia de la secuencia blanco que en este caso pertenece al gen pol de VIH-1 la cadena con el fluoroforo reportero hibridiza a la secuencia blanco y se separa de la cadena corta unida al quencher, por lo tanto la fluorescencia puede ser ahora detectada. Este ensayo usa como control interno de cuantificación un estándar de ARN blindado (Armored ARN), coprocesado con la muestra. Se diferencia del templado muestra amplificado, por que hibidiza con una sonda fluorescente simple cadena. Debido a que no se requiere en este ensayo de la actividad exonuclesasa 5’-3’ de la polimerasa rTth como en el ensayo Taqman, la temperatura de hibridizacion de la sonda es menor que la del paso de amplificación, reduciendo así la posibilidad de un annealing inespecífico de la sonda.
La preparación, amplificación y detección se pueden automatizar usando el equipo m2000sp y m2000rt. El rango dinámico lineal es de 40-107 copias/ml y reconoce los subtipos del grupo M A-H, grupo O y grupo N (13).
Las técnicas de amplificación y detección en tiempo real para la determinación de la carga viral se han transformado de una tecnología experimental, en una poderosa herramienta de uso corriente en el laboratorio de diagnostico para la detección del ARN viral de VIH-1. Esta metodología es un ensayo homogéneo que elimina el procesamiento post PCR, tiene un rango dinámico mas amplio, genera datos cuantitativos de alta calidad, y es altamente especifico y sensible, debido al uso de sondas especificas. Los resultados se obtienen en menor tiempo. Son estas las ventajas principales que generan el impacto de estas metodologías en la comunidad diagnostica (3,4).
Con sistemas químicos de detección altamente eficiente, instrumental sensible y ensayos optimizados que hoy están disponibles, el nº de moléculas de ADN
o ARN de una secuencia viral particular en una mezcla compleja, puede ser determinada con certeza y sensibilidad sin precedentes.

Referencias
1. Raibenberg F. Seguimiento de la infección por VIH-1: El aporte de los métodos moleculares de cuantificación viral. Publicación FABA Informa 2005; año XXXI nº 397. Revista de de la Federación bioquímica de la provincia de Buenos Aires.
2. Heid CA, Stevens J, Livak KJ, Williams PM. Real time quantitative PCR. Genome Res 1996; 6:986-94.
3. Kubista M, Andrade JM, Bengtsson M, Forootan A, Jonak J, Lind K, Sindelka R,
Sjoback R, Sjogreen B, Strombom L, Stahlberg A, Zoric N. The real-time polymerase chain reaction. Mol Aspects Med. 2006 27(2-3):95-125.
4. Mackay, K. M. Arden, A. Nitsche. Real time PCR in virology. Clin Microbiol Infect 2004; 10: 190–212
5. Meng Q, Wong C, Rangachari A, Tamatsukuri S, Sasaki M, Fiss E, Cheng L,
Ramankutty T, Clarke D, Yawata H, Sakakura Y, Hirose T, Impraim C. Automated multiplex assay system for simultaneous detection of hepatitis B virus DNA, hepatitis C virus RNA,
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6. Smith, E. S., Li, A.K., Wang, A.M., Gelfand, D.H., Myers, T.M. (2003). Amplification
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7. Roche Molecular Systems, (2004). COBAS AmpliPrep/COBAS TAQMAN HIV-1 Test, package insert. P/N: 03543005.
8. Katsoulidou A, Petrodaskalaki M, Sypsa V, Papachristou E, Anastassopoulou CG, Gargalianos P, Karafoulidou A, Lazanas M, Kordossis T, Andoniadou A, Hatzakis A. Evaluation of the clinical sensitivity for the quantification of human immunodeficiency virus type 1 RNA in plasma: Comparison of the new COBAS TaqMan HIV-1 with three current HIV-RNA assays—LCx HIV RNA quantitative, VERSANT HIV-1 RNA 3.0 (bDNA) and COBAS AMPLICOR HIV-1 Monitor v1.5. J Virol Methods 2006; 131:168-74.
9. Tyagi S, Bratu DP, Kramer FR. Multicolor molecular beacons for allele discrimination.
Nat Biotechnol 1998; 16:49-53.
10. Weusten JJ, Carpay WM, Oosterlaken TA, van Zuijlen MC, van de Wiel PA. Principles
of quantitation of viral loads using nucleic acid sequence-based amplification in combination with homogeneous detection using molecular beacons. Nucleic Acids Res 2002; 30:e26.
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12.de Mendoza C, Koppelman M, Montes B, Ferre V, Soriano V, Cuypers H, Segondy M, Oosterlaken T. Multicenter evaluation of the NucliSens EasyQ HIV-1 v1.1 assay for the quantitative detection of HIV-1 RNA in plasma. J Virol Methods 2005; 127:54-9.
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14.Abravaya K, Hackett J, Huang S, et al. Novel probe design for real-time HIV-1 assay
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CO. Abstract 663.
15.HIV InSite Knowledge Base Chapter Published May 2006Teri J. Liegler, PhD,
University of California San Francisco