Estandarización en medidas
de actividad enzimática
Dra. Rosana Acheme.LARESBIC (Laboratorio de Referencia y Estandarización en Bioquímica Clínica de la Fundación Bioquímica Argentina)
Las enzimas constituyen una categoría particular de analitos, puesto que en la cuantificación no se mide concentración sino actividad catalítica. En la escala de trazabilidad, el eslabón de mayor jerarquía lo constituye por lo tanto la definición de la unidad de actividad catalítica del Sistema Internacional de Unidades (SI), (katal/litro o m3), y el siguiente escalón está dado por el procedimiento de medida de referencia primario. Los resultados obtenidos con los métodos de rutina y los valores asignados a controles y/o calibradores deberán ser trazables a aquellos obtenidos con los procedimientos de referencia primarios. (ver figura 1).
La norma ISO 18153, que aborda el tema de la trazabilidad en las medidas de concentración catalítica de enzimas, define a la actividad catalítica como: Propiedad de una enzima que se corresponde con la velocidad de conversión de la sustancia catalizada en una reacción química específica, en un sistema de medición específico.
Esta definición indica que la actividad enzimática está definida en el contexto de un sistema de medición específico, o sea, la actividad enzimática es método-dependiente. Por lo tanto, todos los factores definidos en el método de medición influirán en el resultado de la actividad enzimática medida. La siguiente es una lista de diferentes factores definidos en el método de medición:
1- Tipo de sustrato y su concentración
2- Activadores y su concentración
3- Dirección de la reacción catalizada
4- Sistema tampón y pH
5- Tiempo de preincubación
6- Tiempo de reacción
7- Reactivo iniciador
8- Factores instrumentales: temperatura de reacción, linealidad fotométrica, longitud de onda, factores volumétricos, etc.
Variaciones en estas condiciones darán indefectiblemente resultados diferentes. Las concentraciones de sustrato, activadores, inhibidores, pH, etc, van a definir la dirección de la reacción catalizada, y deben ser respetados en forma estricta pues definen el método de medición y por consiguiente la actividad catalítica. De la lista anterior, los factores 1 a 7 vienen definidos en la formulación de los reactivos comerciales y constituyen por lo tanto responsabilidad de los fabricantes respetar dichas condiciones. El bioquímico que realiza las mediciones de actividad enzimática tendrá a su cargo la verificación del estricto cumplimiento de las condiciones instrumentales definidas en los métodos de medida (8), como temperatura de reacción, longitud de onda, linealidad fotométrica y precisión y exactitud de pipeteo.
La presencia en el mercado de muchos métodos de rutina distintos, con diferentes condiciones de reacción trae aparejado una serie de inconvenientes:
• Interpretación de los informes de la Evaluación Externa de la Calidad: muchos materiales de control tienen valores asignados con determinados métodos o con el método de referencia y puede que los valores obtenidos con el método utilizado sean totalmente diferentes (otra temperatura de reacción, otra formulación). También hay materiales de control con valores asignados para sistemas analíticos homogéneos, es decir, para una determinada marca de reactivos y un instrumento en particular, y es complicado transferir esos valores a sistemas analíticos heterogéneos.
• Existencia de múltiples intervalos de referencia biológicos (uno por cada método utilizado) con las dificultades que ello puede traer en la interpretación por parte de los médicos de dichos resultados.
De todo lo planteado surgen 2 recomendaciones:
1- Utilización de métodos de rutina estandarizados o recomendados
2- Calibración de los métodos de rutina con calibradores conmutables con valores asignados mediante métodos de referencia. (Se define conmutabilidad de un material al grado de concordancia entre la relación matemática de los resultados de la medición de dicho material por 2 procedimientos de medición y la relación matemática obtenida en muestras humanas frescas. Es decir, el calibrador se comporta de manera similar a lo que lo haría un suero humano fresco, al analizarlo por diferentes métodos).
Los métodos recomendados básicamente utilizan los mismos principios que los métodos de referencia, con diferencias que hacen a la practicidad de lo que constituye un método de rutina. El procedimiento recomendado ha contribuido exitosamente en mejorar la calidad y comparabilidad de las medidas de enzimas y en la erradicación de métodos analíticos insatisfactorios. Sin embargo, los procedimientos recomendados parecen haber llegado a un límite de utilidad en cuanto a la estandarización. Esto se debe a factores como: ausencia de consenso en la elección del método a lo largo de un variado número de recomendaciones; modificaciones internacionales o no internacionales de los procedimientos recomendados para el uso de rutina; falta de adaptación de estos procedimientos a la automatización, etc. El viraje hacia algún método recomendado es a veces resistida, tanto por el bioquímico como por el médico, pues no solo implica el cambio de sistema analítico sino también el de intervalo de referencia biológico, con las consiguientes dificultades que ello acarrea en el seguimiento de los pacientes. Por otra parte, el uso de calibradores está bastante limitado debido a la pérdida de estabilidad de las enzimas en los materiales de referencia en matrices apropiadas como para usarse como calibradores, disimilitud entre las enzimas presentes en los calibradores y las de las muestras humanas, incluyendo isoformas distintas con la consiguiente falta de conmutabilidad.
La siguiente tabla muestra la variedad de reactivos comerciales para GGT
(Ver tabla 1) La gran diversidad de concentraciones de sustratos, relación de muestra a reactivo, pH de mezcla de reacción, etc, hace que sea muy difícil adaptar los diferentes reactivos disponibles, sobre todo en sistemas analíticos heterogéneos.
Por ello, y como conclusión, la recomendación es la de utilizar métodos recomendados calibrados. El objeto de la utilización de calibradores con trazabilidad metrológica en procedimientos de medición de rutina, es producir un resultado de medición que sea lo mas próximo posible al que se habría obtenido si el procedimiento de medición hubiese sido el de referencia. Así, la veracidad de los resultados dados por un procedimiento de medición de rutina calibrado tienen trazabilidad al procedimiento de medición de referencia
Por último, y como apartado fundamental para el aseguramiento de la calidad de las determinaciones de actividad enzimática, se encuentran los factores instrumentales que definen las condiciones de la reacción. La exactitud de la longitud de onda, la exactitud en las medidas de absorbancia y la linealidad fotométrica son claves para la utilización de los factores de cálculo de la actividad enzimática. La variación de la actividad enzimática con la temperatura depende de cada enzima y va desde un 3 a 4% por grado centígrado para la ALT, un 6 a 7 % para la AST y mas de un 10 % para la FAL. Por lo que la estricta regulación de la temperatura de reacción es un factor de extrema importancia
La utilización de calibradores conmutables, métodos recomendados y el estricto control de las condiciones de reacción instrumentales son los requisitos fundamentales para la estandarización de las medidas de concentración catalítica de enzimas en los laboratorios clínicos.
BIOGRAFIA
• IRAM-ISO 18153: Productos médicos para uso en diagnóstico in vitro. Medición de magnitudes en muestras de origen biológico. Trazabilidad metrológica de los valores de la concentración catalítica de las enzimas asignados a los calibradores y materiales de control.
• ISO 17511: In vitro diagnostic medical devices. Measurement of quantities in biological simples. Metrological traceability of values assigned to calibrators and control materials.
• IFCC Primary Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes at 37°C. Part 1. The Concept of Reference Procedures for the Measurement of Catalytic Activity Concentrations of Enzymes |
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