PEEC
- Química Clínica y LARESBIC
Análisis comparativo de distintas condiciones de reacción
en las determinaciones enzimáticas
Dr. E. Perasso
y Dra. R. Acheme
Introducción:
En el laboratorio clínico es de uso habitual las determinaciones
de la actividad enzimática, que utilizan como sustrato de
medida fotométrica el analito NADH o NADPH, cuya lectura
se realiza en el UV.
Para evaluar dichos sustratos, los laboratorios clínicos
utilizan las siguientes longitudes de onda en sus instrumentos de
medida: 340 nm y 366 nm. Si bien la recomendación de medida
internacional otorgada por la Federación Internacional de
Química Clínica (IFCC), es el uso de la longitud de
onda 340 nm para medir dicho tipo de sustrato, un número
importante de laboratorios, usan otra longitud de onda como la de
366 nm. Es de interés tener en cuenta que, en dichas determinaciones
de actividad enzimática, los laboratorios clínicos
utilizan distintas temperaturas: 25, 30 y 37 ºC en sus condiciones
de reacción. De la misma manera la IFCC recomienda el uso
de 37ºC como temperatura de elección para la medida
de la actividad enzimática.
Objetivos:
Evaluar el desempeño de los laboratorio participantes en
la evaluación externa de calidad en cuanto a las medidas
de actividad enzimática de los analitos AST, ALT y LDH, examinados
en el subprograma de Química Clínica del Programa
de Evaluación Externa de Calidad (PEEC).
Materiales y métodos:
Se evalúan los datos obtenidos en el análisis de la
encuesta 214 del subprograma de Química Clínica del
PEEC.
En el caso de las transaminasas AST y ALT se estudió la población
de participantes que usa la metodología según IFCC
sin piridoxal y en el caso de la LDH la población de participantes
elegida es la que usa la metodología según la Deutsche
Gesellschaft für Klinische Chemie (DGKC).
Para los analitos evaluados aquí la población estudiada
de laboratorios es la siguiente: para AST de 1717 laboratorios,
para ALT de 1735 laboratorios y para LDH de 1690 laboratorios.
Para dicho análisis se utiliza el puntaje F, que es una medida
del desempeño histórico de cada laboratorio, debido
a que en su cálculo se involucran los datos estadísticos
de la encuesta objeto del estudio y de las 5 encuestas previas a
la misma. En condiciones aceptables de funcionamiento, el laboratorio
debe tener un puntaje F menor o igual a 2.
Para evaluar el desempeño de los laboratorios se construyen
los gráficos de porcentaje de participantes acumulados en
función del puntaje F.
Resultados:
A continuación se muestran las curvas obtenidas para la ALT,
AST y LDH donde se evalúa el puntaje F en el uso de distintas
longitudes de onda. En los gráficos 1, 2 y 3 se
puede apreciar el porcentaje de laboratorios que se acumula antes
de alcanzar el valor límite de aceptabilidad de F<=2 (línea
vertical de los gráficos mostrados)
< Gráficos
1, 2 y 3
La interpretación es la siguiente: cuanto mayor es la cantidad
de laboratorios que se acumula antes de alcanzar la cota de aceptabilidad,
mejor desempeño tiene la condición de reacción
seleccionada para la evaluación.
En los gráficos 4, 5 y 6 se muestran los
acumulados cuando se evalúan las distintas temperaturas en
las condiciones de reacción para los mismos analitos.
En todos los casos se realizaron test de estadística no paramétrica
(prueba U de Mann-Whitney y la prueba H de Kruskal-Wallis) para
comprobar si las diferencias encontradas son significativas o no,
hallándose en todos los casos diferencias significativas
en las variables estudiadas (p<0.01).
< Gráficos
4, 5 y 6
Discusión:
De los gráficos mostrados en el apartado anterior se puede
observar que los desempeños son significativamente mejores
cuando se utiliza la longitud de onda de 340 nm frente a la de 366
nm, esto es para los tres analitos evaluados.
De la misma manera se observan diferencias significativas cuando
se usa la temperatura de 37ºC frente a las de 25ºC y 30ºC,
hallándose mejores desempeños de los laboratorios
participantes.
Conclusiones:
El uso de los 366 nm se introdujo inicialmente debido a que los
espectrofotómetros con lámpara de Hg tenían
los 366 nm como única opción en la zona del UV, ya
que esa longitud de onda corresponde al pico de emisión del
Hg. Si observamos el espectro de absorción del NADH vemos
que tiene un pico de máxima absortividad molar en los 340
nm con una pequeña meseta alrededor de dicha longitud de
onda. A ambos lados de dicho pico, hacia longitudes de onda crecientes
y decrecientes, la absortividad molar del NADH disminuye rápidamente.
En 366 nm es aproximadamente el 60% de la absortividad molar de
340nm y está en una zona de pendiente pronunciada del espectro.
Esto hace que pequeños corrimientos en la escala de longitudes
de onda del espectrofotómetro se traduzcan en grandes errores
en la Absorbancia medida, lo que no sucede a 340 nm debido a la
meseta alrededor del pico. El mismo tipo de errores se comete por
anchos de banda excesivos. Esto explica que los errores a 366 sean
muy superiores a los que se observan a 340 nm, por lo que esta longitud
de onda se debería usar solo en los casos en que no se tiene
otra posibilidad (lámpara de Hg).
Con respecto a la temperatura de 37ºC, la explicación
del mejor desempeño respecto a las otras temperaturas radica
en que es la temperatura óptima de actividad enzimática,
ya que es la temperatura fisiológica. Temperaturas menores
dan rendimientos inferiores.
A través de este estudio se pueden observar mejores desempeños
estadísticos de los laboratorios participantes del PEEC,
cuando utilizan las condiciones de reacción recomendadas
por la IFCC, esto es 340 nm y 37ºC para los analitos evaluados,
cuando se los compara con los laboratorios que usan otras condiciones
instrumentales de medida.
(ver gráfico
7)
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