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Comparación de 3 métodos para detectar antígenos de rotavirus en materia fecal

El Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana ha seleccionado este artículo publicado en INFORME ALAC – Ciencia y Ética, Año XI, Nº 2, 2006) para su difusión a través de FABA Informa

Valeria Cuffia - Natalia Guerra - María Díaz Ariza - Ximena Maldonado - Patricia Córdoba. Laboratorio 1, Departamento de Investigación. IUCS Fundación Barceló. Sede La Rioja.

Introducción

Las gastroenteritis virales agudas son una de las principales causas de morbilidad y mortalidad infantil en todo el mundo (1). Los principales agentes virales son Rotavirus, Calicivirus (Virus tipo Norwalk y tipo Sapporo), Astrovirus y Adenovirus entericos (serotipos 40 y 41 ), y con menor trascendencia epidemiológica Coronavirus, Torovirus, Picobirnavirus y Picornavirus (virus Aichi) (2).
Rotavirus es el mayor agente causal de gastroenteritis en niños, produciendo por año aproximadamente 111 millones de episodios, de los cuales 25 millones requieren vistas clínicas, 2 millones de hospitalizaciones y alrededor de 400.000 muertes anuales en el mundo (3). En la Argentina se ha estimado que las diarreas virales infantiles provocan 21.000 hospitalizaciones, 85.000 atenciones ambulatorias y un costo mayor a los 27 millones de dólares (4). En la provincia de La Rioja la diarrea es una de las principales causas de consulta y el diagnóstico de las diarreas virales no se realiza en los laboratorios públicos ni privados. Nuestro grupo de trabajo determinó que el 13,17% de las consultas por diarreas y el 23,13% de las diarreas en hospitalizados son producidas por virus. De las diarreas virales, las producidas por Rotavirus son 81,2% en niños ambulatorios y 82% en hospitalizados (5).
Rotavirus fue observado por primera vez en 1973 en la mucosa duodenal de niños con gastroenteritis. Es un virus de la familia Reoviridae y las partículas maduras son icosahédricas, no envueltas y de 70 nm de diámetro. La cápside contiene una doble capa proteica. La capa externa está compuesta por dos proteínas estructurales, VP7 y VP4 y la capa interna está formada principalmente por VP6. El genoma viral comprende 11 segmentos de ARN de doble cadena y cada segmento genómico codifica para proteínas estructurales y no estructurales. Las proteínas estructurales son VP1, VP2, VP3, VP4, (VP5 + VP8), VP6 y VP7 y las no estructurales NSP1, NSP2, NSP3, y NSP5 (1).
Los Rotavirus son clasificados en grupos, subgrupos y serotipos de acuerdo a la reacción antigénica de las proteínas de la cápside. La proteína VP6 es responsable de la existencia de 7 grupos (A-G). El grupo A se divide en 2 subgrupos (I, II) en función de su especificidad. Las infecciones humanas son producidas principalmente por el grupo A, y en menor medida por los grupos B y C. La proteína VP4 que constituye las espículas del virión y la glucoproteína VP7 de la cápside externa determinan la existencia de serotipos o genotipos P y G, respectivamente (2). Los serotipos o genotipos se determinan de acuerdo al método usado para la tipificación con un panel de anticuerpos para serotipos por RT-PCR para genotipos. Se han identificado hasta el momento 15 genotipos G y 20 genotipos P (6).
Rotavirus puede ser detectado en materia fecal por diversos métodos. Originalmente el microscopio electrónico y la inmunomicroscopía electrónica fueron usados para la detección morfológica e inmunológica de las partículas virales (2). El diagnóstico de la infección por Rotavirus se realiza detectando la presencia de antígeno vírico por métodos inmunológicos en muestras de materia fecal. Estos métodos detectan Rotavirus del grupo A. Actualmente en el mercado se encuentran disponible equipos de Enzimoinmunoensayo (Elisa IVD Inc. Rotavirus antigen detection, Rotazyme II Abbott Laboratorios, Premier Rotaclone), ensayos de Inmunocromatografía (Rotascreen dipstick, VIKIA Rota-Adeno) y pruebas de aglutinación de partículas de látex sensibilizadas (Slidex Rota Kit 2, Biomerieux); este último estuvo disponible en el mercado hasta 2004. Los métodos moleculares detectan la presencia del ARN vírico. Uno de estos métodos es el PAGE (electroforesis en gel de poliacrilamida) que pone de manifiesto los segmentos de ARN bicatenario y es la técnica patrón para la detección de Rotavirus. Otro de estos métodos es RT- PCR (transcriptasa reversa, reacción en cadena de la polimerasa), pero su uso aún no es recomendado para el diagnóstico (2).

Tabla 1. Sensibilidad y Especificidad del ELISA y la IC, utilizando la técnica PAGE como patrón

VP: Verdaderos positivos - VN: Verdaderos Negativos - FP: Falsos Positivos -
FN: Falsos Negativos

Tabla 2 Indice de concordancia entre ELISA e IC

Cada una de estas técnicas tiene perfiles de utilidades diferentes por lo que es importante contar con una marcha diagnóstica para detectar Rotavirus en las diarreas infantiles, que son relevantes en nuestra región. El presente trabajo tiene como objetivo comparar tres métodos diagnósticos disponibles comercialmente para detectar infección por Rotavirus en materia fecal y establecer la utilidad diagnóstica de los mismos.

Materiales y métodos

Se recolectaron 83 muestras de materia fecal de niños menores de 5 años con diarrea aguda que consultaron en el servicio externo de pediatría del Hospital Vera Barros, en el Centro primario Puerta de La Quebrada y en el Centro primario San José de la Capital de la provincia de La Rioja. Las muestras fueron recolectadas en recipientes limpios y secos sin conservante, dentro de las 48 horas de aparición de los síntomas y conservadas a -20° C hasta el momento de procesarlas.
Procesamiento de las muestras
Las muestras de materia fecal fueron procesadas por el método de enzimoinmunoensayo (ELISA) sandwich que utiliza anticuerpos monoclonales contra rotavirus del grupo A (ELISA IVD Ir Rotavirus antigen detection), por Inmunocromatografia (IC) (Roascreen Dipstick) que también detecta rotavirus del Grupo A, utilizando un anticuerpo monoclonal diferente al del ELISA y por electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), previa extracción del ácido nucleico por el método de Pindall, con tinción de nitrato de plata para visualizar los segmentos del ARN viral (perfiles electroforéticos) (7).

Resultados

De las 83 muestras procesadas, 4 fueron positivas y 68 negativas por los tres métodos, con un índice de concordancia del 83,7%. La tabla 1 muestra la sensibilidad y especificidad del ELISA y la IC utilizando el PAGE como técnica patrón.
La sensibilidad determinada para el ELISA fue del 100% y la especificidad del 91%. La IC tuvo una sensibilidad del 91% y una especificidad del 100%.
Cabe destacar que procesando en serie a las muestras ELISA negativas por el método IC, se obtiene una sensibilidad y especificidad del 100% optimizando el diagnóstico de Rotavirus en materia fecal de niños. El índice de concordancia encontrado entre ELISA e IC fue del 90,36% con un valor predictivo negativo para el ELISA del 89,6%; estos datos se observan en la tabla 2.

Discusión

Rotavirus humano es considerado el mayor agente etiológico de diarreas agudas en niños en todo el mundo. Nosotros determinamos en estudios anteriores que en la provincia de La Rioja es el principal virus causante de diarreas agudas. Un diagnóstico rápido, fácil y certero es esencial para un efectivo tratamiento de los pacientes. La implementación del diagnóstico de rutina para Rotavirus en los hospitales públicos y laboratorios privados permitiría optimizar la asignación de los recursos económicos, por el uso indebido de antibióticos y por la infección intrahospitalaria ocasionada por este virus.
En el laboratorio clínico, los métodos inmunológicos son de gran utilidad para la resolución de un diagnóstico de diarrea por Rotavirus, debido a su simpleza en relación a las técnicas moleculares que requieren un laboratorio de alta complejidad.
Nosotros obtuvimos, utilizando ELISA como técnica diagnóstica, un 100% de sensibilidad y un 91% de especificidad. Estos resultados muestran que esta técnica es muy sensible para determinar Rotavirus en materia fecal, aunque requiere un mayor tiempo de procesamiento de la muestra, un laboratorio más equipado y un personal más entrenado. El ELISA es un método muy usado para el diagnóstico de Rotavirus y fue comparado con diferentes métodos como RT-PCR (8)(9), Microscopía Electrónica (l0), látex (11-15), Inmunocromatografía (8)(13)(16) y por PAGE (l0-12) obteniendo resultados similares a los nuestros.
Utilizando la IC como método diagnóstico obtuvimos una especificidad del 100% y una sensibilidad del 91%, que aumenta al 100% procesando las muestras en serie con ELISA sandwich. Estos resultados indican que la IC tiene una alta sensibilidad y especificidad, es rápida, fácil de realizar e interpretar, constituyendo una técnica accesible para los laboratorios clínicos de todo tipo de complejidad. Actualmente la IC es un método tan utilizado como el ELISA, confirmado a través de estudios comparativos realizados por otros autores (13)(16-19) donde obtienen una buena sensibilidad y especificidad para el diagnóstico con resultados similares a los nuestros.
En conclusión, este trabajo muestra que para establecer un diagnóstico de Rotavirus a un costo accesible se puede usar la IC por su buena sensibilidad y especificidad, por la simpleza del procedimiento e interpretación de los resultados.

Agradecimiento

Este proyecto fue realizado con un subsidio otorgado por la Fundación Barceló H. A. de Sede La Rioja. Se agradece la valiosa colaboración a todos los Bioquímicos y técnicos de laboratorio del Hospital Vera Barros, a los residentes de Pediatría, a las autoridades del Hospital Vera Barros, a las autoridades de Salud Pública de la Provincia.

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