ABCL

Diagnóstico de laboratorio
de anticuerpos antifosfolípidos
Se podrá acceder al artículo completo Diagnóstico de laboratorio de anticuerpos antifosfolípidos/2016 publicado en Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana desde
www.scielo.org.ar ingresando al volumen 50, número 2, de 2016

• Ricardo Forastiero:
PhD. Departamento de Fisiología, Universidad Favaloro, Buenos Aires, Argentina

Los anticuerpos antifosfolípidos (aFL) en pacientes con historia de complicaciones clínicas trombóticas, tanto en territorio venoso como arterial y/o con morbilidad obstétrica, definen al síndrome antifosfolípido (SAF).
Los primeros anticuerpos aFL o reaginas fueron detectados en 1906 a través de los ensayos usados para la evaluación de pacientes con sífilis. En 1941 se demostró que en el ensayo de VDRL para sífilis, el antígeno contenía principalmente cardiolipina como uno de sus componentes. En 1952 se publicó el hallazgo de un inhibidor que prolongaba los ensayos dependientes de fosfolípidos. Como esos pacientes tenían lupus eritematoso sistémico (LES) como enfermedad de base, se comenzó a denominar a esos inhibidores circulantes como inhibidor o anticoagulante lúpico (IL) que era detectado a través de la prolongación del APTT. La primera asociación clínica del IL fue reportada en 1954 en pacientes con complicaciones obstétricas. Un poco más tarde, en 1963, se publicó la asociación clínica entre IL y trombosis y se reportaron algunos pacientes con IL que tenían tendencia hemorragípara. Teniendo en cuenta la asociación entre VDRL e IL se pensó que los aFL podrían ser anticuerpos con especificidad contra la cardiolipina. A comienzos de la década del 80 se diseñó un RIA con la intención de evaluar la presencia de anticuerpos anticardiolipina (aCL). Desde ese momento se vio que muchos pacientes tenían ambos resultados positivos en forma simultánea, pero también había un grupo importante que solo presentaba actividad de IL o de aCL. A partir de ese momento, los pacientes con esos aFL y que presentaban historia de complicaciones clínicas trombóticas u obstétricas, fueron denominados como pacientes con síndrome antifosfolípido (SAF).
El SAF es una enfermedad autoinmune que se define por la presencia de aFL en el plasma de pacientes con complicaciones trombóticas tanto en territorio venoso como arterial y/o con morbilidad obstétrica (abortos a repetición, muerte fetal, retardo del crecimiento intrauterino, eclampsia, etc.).
Un hecho fundamental en la historia de los aFL fue puesto en evidencia cuando se demostró que los aFL en realidad se unen primeramente a proteínas con alta afinidad por los fosfolípidos. Esa proteína se conoce como β2 glicoproteína I (β2GPI) y fue reconocida como el principal antígeno de los aFL presentes en pacientes con enfermedades autoinmunes. Al año siguiente se demostró que la protrombina humana era el segundo antígeno en importancia hacia el cual estaban dirigidos algunos aFL. Rápidamente se diseñaron ensayos inmunológicos para detectar anticuerpos anti-β2GPI (aβ2GPI) y anticuerpos anti-protrombina (aPT).

En 1999 se presentaron oficialmente los criterios clínicos y de laboratorio para diagnosticar el SAF. El aumento en la predisposición a la trombosis en pacientes con SAF se debe al fenotipo procoagulante inducido. Entre los mecanismos que contribuyen a ese fenotipo están la activación plaquetaria, endotelial y monocítica por acción de los aFL y las alteraciones en los sistemas antitrombóticos y fibrinolíticos. La inflamación juega un rol importante en las trombosis y es central en la injuria placentaria responsable de las complicaciones obstétricas.
Más recientemente, el consenso de expertos ha actualizado los criterios clínicos y de laboratorio para diagnosticar este síndrome. Los aFL en el plasma de pacientes pueden ser detectados como actividad de IL a través de la prolongación de pruebas de coagulación dependientes de fosfolípidos o a través de ensayos en fase sólida como los ELISA para aCL o aβ2GPI (incorporados a los criterios en 2006). Para el diagnóstico de SAF se requiere que los aFL sean demostrados en al menos 2 oportunidades con un período no menor a 12 semanas entre ambas evaluaciones de laboratorio. Los aCL y/o aβ2GPI de isotipo IgG y/o IgM deben estar presentes en títulos moderados o altos.

Rol clínico del perfil de aFL
Con la evaluación de los 3 aFL incorporados a los criterios diagnósticos del SAF desde 2006 y el estudio por parte de diferentes grupos de investigadores de otros anticuerpos de la familia de aFL (no incluidos en los criterios del SAF), se ha observado que no todos los aFL tienen el mismo rol en el riesgo clínico. El IL es uno de los aFL con mayor asociación con el riesgo trombótico. Dentro de los aFL detectados inmunológicamente, la presencia de aβ2GPI parece ser un mejor marcador que la de aCL. En particular, cuando los aFL son del isotipo IgG. El riesgo tromboembólico asociado a aCL y aβ2GPI se incrementa en forma paralela con el título de anticuerpos y cuando los pacientes tienen combinación de aFL. Distintos trabajos publicados en los últimos años han remarcado, a través de estudios prospectivos, que el perfil de positividad de los aFL es importante para definir el riesgo clínico de los pacientes. Es probable que la triple positividad sea debida a los aβ2GPI dirigidos contra el dominio I de la aβ2GPI. El concepto actual es que la triple positividad (IL + aβ2GPI + aCL) confiere un mayor riesgo al desarrollo del primer evento de trombosis o a la recurrencia tromboembólica. La familia de aFL incluye además otros anticuerpos tales como aPT y anti-complejo PT-fosfatidilserina (aPT/PS). El riesgo de eventos clínicos aumenta progresivamente con el número de ensayos positivos de aFL y la positividad múltiple en aFL parece ser el único perfil que identifica pacientes de alto riesgo de trombosis. En base a estos hallazgos se ha propuesto recategorizar a los pacientes con aFL tanto con enfermedad trombótica como en mujeres con complicaciones obstétricas.

• Artículo publicado en ABCL volumen 50 Nº 2 - 2016

Laboratorio para el estudio del anticoagulante lúpico
El IL se diagnostica en el laboratorio a través de diversas pruebas de coagulación. Los criterios de 1995 confirmados en 2005 requieren el cumplimiento de cuatro etapas secuenciales:

1. prolongación de los ensayos de coagulación dependientes de fosfolípidos (pruebas de detección),
2. demostración de la presencia de un inhibidor a través de mezclas con plasma normal,
3. evidencia de la dependencia de fosfolípidos que tiene el inhibidor (pruebas confirmatorias),
4. descartar o discernir la presencia de otras coagulopatías que puedan provocar confusión en el diagnóstico. El diagnóstico de IL requiere la prolongación de al menos una prueba de detección, efecto inhibitorio en los ensayos de mezcla y al menos una prueba de confirmación positiva.

Procesamiento de la muestra a estudiar
Un punto importante es que el paciente debe estar libre de medicación al momento de la toma de muestra, particularmente en lo que se refiere a la ingesta de anticoagulantes directos o la administración de heparinas. En el caso de estar bajo esos tratamientos se debe recomendar al médico tratante la suspensión por al menos las 72 horas previas o antes de la próxima inyección, en el caso de heparina. La sangre debe ser extraída con jeringa seca (sin heparina) por punción venosa con estasis venoso mínimo, o en caso de no poseer acceso venoso, por punción arterial directa no traumática. Se debe recolectar en tubos plásticos que contengan citrato de sodio 0,11M en proporción de 1 parte de anticoagulante por cada 9 de sangre. Para la obtención del plasma pobre en plaquetas, la sangre se debe centrifugar durante 10 min a 2000-2500 g (4000-5500 rpm). El plasma obtenido se trasvasa a otro tubo plástico y se recentrifuga durante 15 min a la misma velocidad. Trasvasar el plasma obtenido en esta etapa (recuento plaquetario <10x109/L) a otro tubo y guardarlo a temperatura ambiente hasta ser procesado (<2 horas). No se recomienda guardarlo en heladera (excepto cuando la temperatura del laboratorio sea >30 °C), para evitar posibles activaciones que pueden ocurrir en frío y la precipitación de crioglobulinas o criofibrinógeno. En caso de no procesar la muestra en el momento, y asegurándose de que el recuento plaquetario del plasma sea inferior a 5x109/L, la muestra puede ser conservada a -80 °C. La recomendación es utilizar los plasmas frescos para el diagnóstico de IL. La preparación del pool de plasmas normales es muy importante para evitar falsos negativos. Debe hacerse de la misma forma que el plasma de los pacientes, utilizando por lo menos 20 sujetos sanos con estudios básicos de coagulación normales. Es importante aclarar que a todo paciente al que se le esté investigando la presencia de un IL se le debe realizar un coagulograma básico para la mejor interpretación de los resultados que debe incluir la determinación del tiempo de trombina para excluir la presencia de heparina.

Pruebas de detección
Los ensayos recomendados son el tiempo de veneno de víbora de Russel diluido (dRVVT) y el APTT. Con respecto a los reactivos a utilizar es importante seleccionar aquellos que posean una alta sensibilidad para la detección de IL.

Ensayos de mezclas
Para determinar si la prolongación de un ensayo de detección es debida a un inhibidor se realiza el mismo ensayo sobre una mezcla del plasma del paciente con un pool de plasmas normales.

Pruebas de confirmación
Estas pruebas son las que confirman la naturaleza dependiente de fosfolípidos del efecto inhibitorio, y necesitan ser altamente específicas ya que son las que diagnosticarán la presencia de IL.

Expresión de resultados
La sugerencia en común para todas las pruebas de detección, mezclas y confirmatorias es expresar los resultados como la razón de tiempos del paciente respecto al resultado obtenido en el pool normal.

Conceptos actuales
Con posterioridad a 2006, cuando se presentaron los últimos criterios para el diagnóstico del SAF, hubo una serie de nuevos conocimientos en esta área:

1. No todos los aβ2GPI son patogénicos (relevancia de anticuerpos anti-dominio I).

2. El título de aβ2GPI se relaciona a la capacidad de producir actividad de IL.

3. El concepto de que el perfil de aFL es útil en definir el riesgo de eventos clínicos relacionados al SAF.

4. Varios estudios clínicos prospectivos remarcan la relevancia clínica de los anticuerpos aPT y/o aPT/PS.

Los pacientes con los títulos más altos de aβ2GPI son los que presentan actividad de IL dependiente de aβ2GPI mientras que aquellos con títulos de aβ2GPI más bajos no tienen actividad de IL.
El perfil de positividad de los distintos ensayos usados para detectar aFL es importante para definir el riesgo clínico de los pacientes. El concepto actual es que la triple positividad (IL+aβ2GPI+aCL) confiere un mayor riesgo al desarrollo del primer evento de trombosis o a la recurrencia tromboembólica.
Los aPT no están aún incluidos como criterios de laboratorio para el SAF pero hay algunos estudios prospectivos recientes que remarcan que su presencia se asocia
con un mayor riesgo tromboembólico.
Seguramente hacen faltan más estudios antes que estos anticuerpos se incorporen al panel para el diagnóstico de SAF. La evaluación de aPS/PT podría ayudar a definir pacientes de riesgo, sin embargo, es importante recordar que por ahora solo IL, aCL y aβ2GPI permanecen como criterios de laboratorio para definir el perfil de riesgo de los pacientes con aFL.