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11 de Abril: Día mundial del Parkinson
Una proteína clave y enigmática en la enfermedad de Parkinson
Bioquímicos del Conicet en el INIBIOLP están abocados a desentrañar el rol tóxico de la alfa sinucleína en esta enfermedad neurodegenerativa y aspiran a encontrar un marcador molecular capaz de detectarla precozmente




Por Ana M. Pertierra

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que afecta el movimiento. Sus síntomas más comunes son el resultado de la pérdida de neuronas productoras de dopamina en un área cerca de la base del cerebro conocida como sustancia negra. La dopamina es un mensajero químico responsable de transmitir señales entre la sustancia negra y el cuerpo estriado del cerebro, para producir movimientos uniformes y deliberados.
Se ha demostrado que las neuronas afectadas en el Parkinson contienen cuerpos de Lewy, acumulación anormal de la proteína alfa-sinucleína.
Se desconoce la causa exacta de la enfermedad de Parkinson, aunque algunos casos son hereditarios y se pueden deber a mutaciones genéticas específicas. Sin embargo, la mayoría de los casos son esporádicos, lo que quiere decir que la enfermedad generalmente no es hereditaria. Se cree que la enfermedad de Parkinson probablemente es el resultado de una combinación de susceptibilidad genética y exposición a uno o más factores ambientales desconocidos que desencadenan la enfermedad.

• A la izq. Dr. Lisandro Falomir Lockhart junto a su equipo de investigación en el INIBIOLP.

FABAINFORMA entrevistó al Dr. Lisandro Falomir Lockhart, bioquímico investigador asistente del CONICET en el Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata (INIBIOLP, CONICET-UNLP), que junto a su equipo trabaja con el objetivo de identificar qué es lo que desencadena la enfermedad. Para eso, están dedicados al estudio exhaustivo de la proteína alfa sinucleína para desentrañar el papel que juega en el daño neuronal. También trabajan para identificar un marcador específico y generar herramientas que permitan detectarlo y cuantificarlo en forma eficiente y práctica para su uso clínico.

• Ciertas neuronas de las personas con enfermedad de Parkinson contienen cuerpos de Lewy, que son depósitos de la proteína alfa-sinucleína. ¿A qué se debe este fenómeno? ¿Es exclusivo del Parkinson o sucede en otras enfermedades neurodegenerativas?

En realidad, hasta el momento no se sabe si la acumulación anormal de proteínas en forma insoluble en neuronas es causa o consecuencia para la Enfermedad de Parkinson. Hay varias proteínas que se agregan y forman parte de los Cuerpos de Lewy, pero alfa-Sinucleína (aSyn) pareciera ser la mayoritaria en los casos de Parkinson, Demencia con Cuerpos de Lewy, y Atrofia de Múltiples Sistemas (o MSA). Otras enfermedades neurodegenerativas también transcurren la formación de agregados proteícos insolubles, a veces en forma intracelular, como en la Enfermedad de Parkinson o de Huntington, y otras en forma extracelular, como la enfermedad de Alzheimer. Pero este no es un fenómeno exclusivo de este conjunto de enfermedades mentales, hay otras enfermedades en las que se encuentran agregados proteicos anómalos en forma sistémica, como algunas formas de ateroesclerosis o enfermedades autoinmunes; e incluso en Diabetes se han encontrado depósitos de insulina anómalos. Muchos de estos agregados proteicos insolubles anómalos tienen características estructurales comunes, por lo que reciben el nombre de ¨Amiloidosis¨ (porque en las tinciones histológicas que primero los identificaron parecían gránulos de almidón). Pero lo cierto es que, en la naturaleza, la agregación de proteínas en un fenómeno común y necesario, como en la formación del tejido conectivo de los tendones, o la seda de los gusanos o la telaraña. El problema aparece cuando una proteína que no debería agregase en forma insoluble lo hace, o lo hace donde no debe.
Lamentablemente, aún no hemos podido identificar las razones que llevan a este comportamiento patológico de las proteínas amiloideas, y por eso muchos grupos de investigación en el mundo están estudiando este fenómeno. Incluso hasta podría aprovecharse en procesos biotecnológicos o en medicina, tales como en el desarrollo de terapias para tratar lesiones de médula espinal.

• ¿Cuál es la función fisiológica de la alfa-sinucleína? 

Esa es otra de las grandes incógnitas que tenemos sobre esta proteína. Aún no se le ha podido asociar una función específica a la aSyn. Sabemos cómo se comporta in vitro (en un tubo de ensayo), asociándose a membranas de fosfolípidos o micelas de detergentes, por lo que se cree que sus funciones principales estarían asociadas al transporte de vesículas en el citosol, ya sea entre retículo endoplásmico y distintos sacos del Golgi, la membrana plasmática y endo/lisosomas. Especialmente atractiva es la hipótesis de que participaría de fusión y remodelado de vesículas sinápticas y la liberación de neurotransmisores. Existen algunas evidencias de esto, pero aún falta una confirmación inequívoca, así como también hay evidencias que la vinculan al funcionamiento mitocondrial, a la regulación de la transcripción de genes o al control del metabolismo de lípidos. Por ejemplo, los niveles de aSyn son inusualmente altos en eritrocitos, un saco lleno de hemoglobina para el transporte de gases en la sangre.
La proteína aSyn tiene una peculiaridad, pertenece al grupo de proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP). Es decir, no tiene una estructura tridimensional tradicional, una "conformación nativa", sino que se mantiene en solución parcialmente desordenada, y es la interacción con otros componentes celulares la que la ayuda o induce a adoptar una conformación determinada, y quizás a cumplir una función determinada. Las IDPs se comportan como comodines que sensan su entorno modificando su estructura, y quizás una función distinta a las de las otras conformaciones posibles. Por ejemplo, cuando aSyn está en solución parecería tener una forma de anillo muy flexible, como una serpiente que se muerde la cola; mientras que si une a membranas fosfolipídicas adopta una estructura helicoidal en los primeros dos tercios de su secuencia, exponiendo el tercio final. En cambio, en los agregados amiloideos, tanto el extremo N-terminal como el C-terminal están expuestos, mientras que la región central queda oculta en las fibrillas amiloides.
Por otro lado, aSyn no parece ser indispensable. Ya sea porque otras proteínas pueden cumplir lo suficientemente bien las mismas funciones, por ejemplo, beta- y gamma-Sinucleínas, o porque sus funciones son prescindibles. Se han diseñado ratones que carecen del gen snca que codifica para la aSyn murina, y los mismos no sólo son viables, sino que llegan a la edad adulta y son fértiles.
Debo confesar que hay mucho interés por descubrir la/s función/es específicas de aSyn, lo que ha llevado a que se propongan muchas alternativas. Por lo que será necesario estudiar todas a conciencia y en forma sistemática antes de poder definir bien cuáles son las realmente importantes. Lo que se acepta por el momento, dentro de la Enfermedad de Parkinson, es que la proteína gana cierta actividad tóxica que sería responsable del proceso patológico.

• Usted junto a su equipo están abocados al estudio exhaustivo de esta proteína para determinar la causa de que dicha molécula adopte una función tóxica para las neuronas. ¿En qué consiste este estudio? ¿Cuáles son los principales objetivos? ¿Sobre qué material hacen los ensayos?

En algunos pacientes que muestran formas hereditarias de la Enfermedad de Parkinson se han identificado una serie de mutaciones en distintos genes. Sin embargo, en la mayoría de los casos, el gen que codifica para la proteína aSyn no presenta alteraciones. Por otro lado, originalmente se creía que los agregados proteicos maduros eran responsables de la enfermedad. Pero rápidamente se observó que no había una correlación entre la abundancia o tamaño de los Cuerpos de Lewy y la severidad o el grado de avance de la enfermedad. Todo esto llevó a pensar que, en realidad, las especies tóxicas eran alguna forma modificada de la proteína salvaje. Es por eso que nos hemos centrado en las modificaciones químicas que puede sufrir la proteína aSyn. Hay más de 400 modificaciones post-traduccionales que se han descripto en proteínas, y nuestra hipótesis es que algunas de ellas podrían estar asociadas a los primeros eventos moleculares que dan origen a las synucelopatías. En particular comenzamos estudiando el efecto de modificaciones asociadas al estrés oxidativo, un factor que se sabe que está asociado a la patología de la Enfermedad de Parkinson.
Nuestro objetivo es, modelando distintas modificaciones post-traduccionales de aSyn in vitro, poder identificar aquellas que se inducen en aSyn bajo condiciones de estrés y cuáles son responsables de una ganancia de función tóxica en la proteína, para desarrollar luego herramientas que permitan su detección temprana en muestras de pacientes.

• ¿Qué metodología utilizan en el INIBIOLP?

En el laboratorio empleamos una batería de técnicas que abarcan biología molecular para generar variantes de aSyn, expresión en bacterias y purificación de proteínas recombinantes, química de proteínas para producir parte de las modificaciones posttraduccionales, espectroscopía de fluorescencia y técnicas bioquímicas para caracterizar el comportamiento de las proteínas modificadas, y cultivo de celulas para estudiar la toxicidad de las mismas.

• ¿Cuáles han sido las primeras conclusiones de estos estudios y qué otros proyectan?

El proyecto en realidad comenzó en Alemania durante mi estadía postdoctoral en el Max Planck Institute for Biophysical Chemsitry de Göttingen. Trabajando con otro argentino ahora radicado en Santiago del Estero, el Dr. Claudio D. Borsarelli, pudimos producir en forma controlada especies oxidadas de aSyn mediante una técnica fotoquímica que sólo modifica los residuos de Tirosina de la proteína, induciendo principalmente entrecruzamientos covalentes de DiTyrosina (DiTyr) entre monómeros de aSyn. Estas especies demostraron, en contra de nuestra suposición inicial, una menor tendencia a formar agregados amiloideos y, además, una toxicidad exacerbada sobre un modelo de neuronas dopaminérgicas en cultivo. Ahora hemos adaptado esta técnica para estudiar la conformación de la proteína en la interfase de vesículas fosfolipídicas y para formar especies nitradas. El proyecto incluye incluir también otras modificaciones como fosforilación o glicación, comparando la suceptibilidad de mutantes clínicos, asociados a una mayor probabilidad de desarrollar la enfermedad. Las especies que muestren mayor comportamiento tóxico serán empleadas como patrones para desarrollar estrategias de detección por imnunoensayos o por espectrometría de masas en muestras biológicas complejas.

• ¿Qué rol juega el estrés oxidativo en la estabilidad y función de la alfa-sinucleína?

Esta es otra de las preguntas que queremos contestar. La posibilidad de que la proteína adopte distintas conformaciones debido a distintas modificaciones post-traduccionales nos permite suponer que la proteína podría funcionar como un sensor de señales de estrés o como scavenger de radicales. Sin embargo, nuestra hipótesis es que las modificaciones oxidativas gatillan las actividades tóxicas de aSyn, por ejemplo, bloqueando los mecanismos de depuración de proteínas mal plegadas , como los del proteasoma y autofagocitosis lysosomal.

• ¿Sería posible en un futuro cercano identificar algún marcador específico que se anticipara a la aparición de los síntomas de la enfermedad?

Nosotros creemos que sí, y trabajamos para tratar de identificarlo y así poder generar las herramientas que permitan detectarlo y cuantificarlo en forma eficiente y práctica para su uso clínico. Aún estamos un poco lejos quizás, pero creo que vamos por el camino correcto. Y para llegar más rápido a nuestro objetivo estamos tratando de establecer nuevas colaboraciones con otros grupos de investigación que complementen nuestro trabajo.

• ¿Cómo está integrado el equipo de investigación del INIBIOLP?

El grupo que trabaja en este proyecto es parte de un laboratorio que cuenta 4 investigadores de CONICET, 2 becarios postdoctorales y 4 estudiantes doctorales, además de 6 estudiantes de grado. Los que están directamente involucrados a esta línea de trabajo y trabajan bajo mi supervisión son el Dr. Andrés Martín Toscani, egresado de Biología de la Univ. de Luján y Dr. de la UBA, Ezequiel Giménez , Licenciado en Biotecnología y Biología Molecular de la Fac. de Cs. Exactas, UNLP) y los estudiantes de grado Antonella León (Lic en Genética de la UNNOBA), María Alejandra Carrero Rivero y Gian Franco Cavazzutti, ambos de la Fac. de Cs. Exactas, UNLP, además de la coordinadora del laboratorio, la Dra. Betina Córsico, Investigadora Principal de CONICET y Prof. Titular de la Fac. de Cs. Exactas, UNLP.