FBA

Primer Consenso Argentino para la Estandarización de la Determinación de Anticuerpos Anti-Nucleares por Inmunofluorescencia Indirecta – HEp-2
Organizadores: Carballo OG (Coordinador), Ingénito FB, Ginaca A, Carabajal P, Costa MA, Balbaryski J.
Participantes: Arana RM, Guilleron C, Stafuza MG, Roquel L, Mitsui M, Arcavi M, Catoggio LJ, Yamamoto L, Da Representacao SR, Vergini V, Eichelmann AI, Larregina A, Schoijedman A, Manti V, Etchevez PC, Murgo RD, Lapena MA, Orfus G, Aristimuño AM, Ori DB, Lirssi ML, Yeyati E, Pérez Colman MF.


La presencia de anticuerpos anti-nucleares (ANA) es el denominador común de muchas enfermedades autoinmunes sistémicas. En la actualidad la técnica más utilizada para su investigación es la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) utilizando células HEp-2 como sustrato. La primera referencia histórica de ANA son las células LE descriptas por Hargraves en 1948, cuando, en una punción de médula ósea, describió la presencia de fagocitosis de material nuclear intacto – opsonizado por autoanticuerpos – por leucocitos polimorfo nucleares (Hargraves M, Richmond H, Morton R.. Presentation of two bone marrow components, the tart cell and the LE cell. Mayo Clin Proc 1948;27:25-8.). Luego, la utilización de cortes de tejido de roedores como sustrato en la IFI proveyó un método más conveniente y sensible. Distintos investigadores fueron responsables de la utilización de la IFI para la investigación de los ANA (Holborow EJ, Weir DM, Johnson GD : A serum factor in lupus erythematosus with affinity for tissue nuclei. Br Med J 1957; 2: 732-57. Friou CJ. Clinical application of lupus serum nucleoprotein reaction using fluorescent antibody technique. J Clin Invest 1957;36:890-7. Holman HR, Kunkel HG.. Affinity between the LE factor and cell nucleic acid nucleoprotein. Science 1957;126:162-3.) Sobre estos tejidos se pueden distinguir principalmente cuatro patrones fluorescentes: Homogéneo, Periférico, Nucleolar y Moteado. Posteriormente la utilización de distintas líneas celulares humanas se impusieron a los cortes de tejidos y los trabajos de Eng Tan (The Scripps Researche Institute, California, USA) en las décadas de los 70 y 80 con el uso de las HEp-2 llevaron a la descripción de un gran número de patrones (más de cuarenta) que son consecuencia de distintos autoanticuerpos contra diferentes estructuras celulares (núcleo, citoplasma, nucleolo y aparato mitótico).

Informe • Título: Anticuerpos anti-Nucleocitoplasmático (FAN/AAN) - Método: Inmunofluorescencia Indirecta - Sustrato: HEp-2 - Dilución de corte: 1:80 (o la que el laboratorio haya definido) • Resultado - Nucleares: POSITIVO/NEGATIVO Título: se informa la última dilución positiva Patrón: se informa el patrón - Citoplasmáticos: POSITIVO/NEGATIVO Título: se informa la última dilución positiva Patrón: se informa el patrón • Observaciones:

-Figura 1: Informe sugerido (ejemplo).

La idea de la organización de un Consenso Para la Estandarización de la Determinación de Anticuerpos Anti-nucleares por Inmunofluorescencia Indirecta - HEp-2, surge de la problemática encontrada en esta práctica.
• No hay unanimidad de criterio para el título de corte, esto es: valor de referencia, la recomendación es que cada laboratorio investigue cual es el valor de corte, teniendo en cuenta edad y sexo.
• Título del informe: habitualmente denominado FAN (factor anti-núcleo) o ANA (anticuerpos anti-nucleares). Estos nombre se interpretan como anticuerpos dirigidos contra antígenos exclusivamente nucleares, dejando fuera algunos que, a priori, se consideran anti-nucleares pero el patrón es o citoplasmático, mixto o contra otra estructura celular, como por ejemplo el anti-Ribosomal P (patrón nucleolar y citoplasmático), anti-NuMA1 o 2 (patrón dirigido contra el aparato mitótico), anti-Jo1 (patrón citoplasmático) y otros que sin ser anti-nucleares tienen una relevancia diagnóstica importante y no sabríamos como ubicarlos ya que son puramente citoplasmáticas, como por ejemplo anti-mitocondriales (patrón citoplasmático reticular) o anti-actina (patrón citoplasmático fibrilar lineal)
• No hay consenso referido al contenido del informe: cuales son los datos más relevantes y cuales no deben faltar. Los distintos informes tienen como consecuencia errores en la interpretación médica.
• Nombre de los patrones: se utilizan distintos nombres para identificar los mismos patrones, este hecho se debe a que el nombre de los patrones surge, en general, de la traducción del inglés al español.
El día 29 de agosto un grupo de expertos nos reunimos en el aula de la Fundación Bioquímica Argentina en la ciudad de Buenos Aires con el objeto de llevar a cabo el Primer Consenso Argentino para la estandarización de la Determinación de Anticuerpos anti-Nucleares por Inmunofluorescencia Indirecta – HEp-2. Tuvimos la posibilidad de compartir 4 hs. de trabajo conjunto, 27 bioquímicos y 2 médicos, donde fueron presentados los distintos problemas que presenta esta determinación.

1- Nuclear a- Periférico Lineal Granular b- Homogéneo c- Moteado Fino Fino denso Grueso Grueso tipo matriz d- Moteado Pleomórfico (PCNA) e- Moteado Puntos nucleares f- Centromérico 2- Nucleolar A- Homogéneo B- Granular C- Aglomerado

3- Citoplasmático A- Reticular B- Granular Escaso Fino Fino denso C- Granular Polar D- Fibrilar Lineal Filamentar Segmental 4- Aparato mitóticos a- Centríolo b- Huso Mitótico NuMA1 NuMA2 c- Cuerpo Medio

- Tabla 1: Clasificación de patrones obligatorios (en Azul) y no obligatorios.

Primeramente el Dr. Gabriel Carballo mostró los resultados del Subprograma de Autoanticuerpos del Programa de Evaluación Externa de la Calidad y los problemas encontrados en el reconocimiento de los diferentes patrones, alto porcentaje de errores clericales, la gran dispersión de títulos y una propuesta de clasificación y reconocimiento de patrones obligatorios y otros optativos, no obligatorios. Luego la Dra. Marta Costa hizo distintas consideraciones técnicas respecto al sustrato, muestras, anti gamma globulina marcada (conjugado), rango de referencia, controles internos, microscopio, técnica y lectura.
Muchas fueron las consideraciones:
• Sustrato: se hizo principalmente hincapié en la evaluación de las improntas con controles trazables de los distintos patrones para analizar el comportamiento de las mismas, probar el sustrato con un suero positivo para SSA/Ro ya que este sustrato es pobre en este antígeno.
• Muestra: se recomendó realizar la técnica sobre suero y si la determinación no se realizaba en el día el suero se puede conservar hasta 3 días de 2 a 8 ºC, y por mayores períodos de tiempo se debe congelar a -20 ºC evitando las sucesivas congelaciones y descongelaciones.
• Conjugado: puede ser de isotipo IgG o polivalente (anti-GAM) donde la relación molar Fluorocromo/Proteína debe estar entre 2,5 – 4,0 y la relación anticuerpo/proteína debe ser menor o igual a 0,1. El contenido de anticuerpo específico debe estar entre 30 y 60 ?g/ml.
• Titulación del conjugado: es muy importante determinar la dilución de trabajo del conjugado, titulándolo utilizando diluciones seriadas de un control primario o secundario positivo.
• Intervalo de referencia: cada laboratorio debe establecer su intervalo de referencia, teniendo en cuenta la edad del paciente. Dentro de los controles internos es recomendable incorporar un suero control anti-SSA/Ro positivo para determinar la presencia de este antígeno en el sustrato.
• Cuidados en el microscopio:

Luego de hacer las propuestas y votar los patrones designados como obligatorios están indicados en la tabla 1, y el informe sugerido en la figura 1.

Diagnóstico	Frecuencia (%)
Lupus Eritematoso Sistémico Esclerodermia EMTC PM / DM Artritis Reumatoidea Vasculitis Reumatoide Síndrome de Sjögren Lupus inducido por drogas Lupus discoide Artritis crónica juvenil pauciarticular Tiroiditis de Hashimoto Enfermedad de Graves Hepatitis autoinmune Hipertensión pulmonar primaria Colangitis autoinmune primaria	95 – 100 % 60 – 80 100 61 52 30 – 50 40 – 70 100 15 71 46 50 100 40 100

-Tabla 1: Frecuencia de anticuerpos anti-nucleares y enfermedad

La presencia de anticuerpos anti-nucleares (ANA) es el denominador común de muchas enfermedades autoinmunes sistémicas. En la actualidad la técnica más utilizada para su investigación es la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) utilizando células HEp-2 como sustrato. La primera referencia histórica de ANA son las células LE descriptas por Hargraves en 1948, cuando en una punción de médula ósea describió la presencia de fagocitosis de material nuclear intacto, opsonizado por autoanticuerpos, por leucocitos polimorfo nucleares (Hargraves M, Richmond H, Morton R.. Presentation of two bone marrow components, the tart cell and the LE cell. Mayo Clin Proc 1948;27:25-8.).
Luego, la utilización de cortes de tejido de roedores como sustrato en la IFI proveyó un método más conveniente y sensible. Distintos investigadores fueron responsables de la utilización de la IFI para la investigación de los ANA (Holborow EJ, Weir DM, Johnson GD : A serum factor in lupus erythematosus with affinity for tissue nuclei. Br Med J 1957; 2: 732-57. Friou CJ. Clinical application of lupus serum nucleoprotein reaction using fluorescent antibody technique. J Clin Invest 1957;36:890-7. Holman HR, Kunkel HG.. Affinity between the LE factor and cell nucleic acid nucleoprotein. Science 1957;126:162-3.) Sobre estos tejidos se pueden distinguir principalmente cuatro patrones fluorescentes: Homogéneo, Periférico, Nucleolar y Moteado. Posteriormente la utilización de distintas líneas celulares humanas se impusieron a los cortes de tejidos y los trabajos de Eng Tan (The Scripps Researche Institute, California, USA) en las décadas de los 70 y 80 con el uso de las HEp-2 llevaron a la descripción de un gran número de patrones (más de cuarenta) que son consecuencia de distintos autoanticuerpos contra estructuras del núcleo, citoplasma, nucleolo y aparato mitótico.
Los ANA son el denominador común de muchas enfermedades autoinmunes sistémicas (tabla 1)
• Textbook of the Autoimmune disease. Ed: RG Lahita, N Chiorazzi and H Reeves. Lippincott Williams and Nilkins, Philadelphia. 2000
• Czaja AJ, Nishioka M, Morshed SA, Hachiya T. Pattrns of nuclear immunofluorescence and reactivities to recombinant nuclear antigens in autoimmune hepatitis. Gastroenterology, 1994; 107:2000
• Rich S, Kieras K, Hart K et al. Antinuclear antibodies in primery pulmonary hypertension J Am Col Cardol 1986;8:1307
• Taylor SL, Dean PJ, Riely CA. Primary autoimmune cholangitis: an alternative to anti-mitochondrial antibodies negative primary pulmonary hipertension. Am J Surg Pathol 1994;18:91
Algunos patrones fluorescentes son relativamente inespecíficos como por ejemplo los patrones nucleares moteado grueso y fino, con posible asociación a los anticuerpos anti-Sm, anti-RNP, anti-SSA/Ro y anti-SSB/La, necesitando de técnicas específicas para definir la correcta especificidad (ELISA, Western blot, Hemoaglutinación, etc). Otros patrones son sumamente específicos donde por si mismos puede definir el autoanticuerpo involucrado como el anti-centrómero.
A pesar que la técnica de ANA por IFI utilizando HEp-2 como sustrato tiene una gran difusión entre los laboratorio por ser muy sensible, fácil de realizar con capacidad de detectar una gran cantidad de autoanticuerpos, presenta una serie de inconvenientes. Alguno de los cuales tiene que ver con la evolución de este tema en el tiempo, como ser la falta de controles primarios de patrones con los cuales el profesional pueda comparar el patrón, falta de controles primarios para titular el anticuerpo antiinmunolgpobulinas humanas conjugado con fluoresceína, la utilización de nombre de patrones que surgen de la traducción del ingles con el resultado de una variedad de denominaciones para el mismo patrón (puntilleado, granular, moteado, etc), ausencia en la estandarización del informe, incluso del título del informe. Todo esto lleva a dificultades en la interpretación de los resultados para el médico.