El Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana ha seleccionado y adaptado este artículo publicado en INFORME ALAC. Ciencia y Etica (Año X - Nº 1 - 2005) para su difusión a través de FABA Informa

Dr. Alfredo Martínez
Laboratorio de Virología Clínica. CEMIC, Galván 4102. Buenos Aires, Argentina amartinez@cemic.edu.ar

INTRODUCCIÓN

El Virus C es el único miembro del género Hepacivirus dentro de la familia Flaviviridae. Es un virus envuelto de 55-65 nm de diámetro cuyo genoma está constituido por una única hebra de ARN de polaridad positiva de 9600 nucleótidos, que se caracteriza por su alta variabilidad genómica.
Las relaciones filogenéticas realizadas a partir de secuencias genómicas obtenidas en diversas partes del mundo permitieron la clasificación en 6 grupos mayores llamados Clados numerados del 1 al 6, los que a su vez –algunos de ellos- incluyen más de un tipo (genotipo), y dentro de estos un extenso número de subgrupos (subtipos) identificados con un número y un subíndice con letra minúscula por ej. 1a, 1b, 1c....2a, 2c, etc. Los clados difieren entre sí entre un 31 y un 34% en sus secuencias nucleotídicas, mientras que la diferencia entre los subtipos alcanza un 20-23%, observándose aún importantes diferencias de acuerdo a la región genómica analizada.
El hombre constituye el único huésped natural del HCV, y la vía de transmisión más efectiva es la parenteral, siendo la drogadicción endovenosa y la transfusión de sangre las principales fuentes.
No se dispone de cultivos celulares ni de modelos animales adecuados para estudios de multiplicación y replicación viral, lo que dificulta el estudio de la persistencia viral y el desarrollo de terapéuticas (antivirales y vacunas) dirigidas a contrarrestar la infección crónica. De igual modo existe controversia con la historia natural de la infección de HCV, porque la mayoría de las personas que desarrollan Hepatitis C aguda no presentan síntomas por lo que es muy difícil reconocer el comienzo de la enfermedad. Si bien la progresión de hepatitis aguda a crónica tradicionalmente es definida como la persistencia de niveles elevados de las transaminasas por 6 meses o más, la hepatitis C crónica se define por la persistencia de Virus C en sangre por el mismo período de tiempo. Las persistencia viral sucede en un 54% a 86% de los casos de HCV aguda, y la transición de HCV aguda a crónica casi siempre ocurre en ausencia de síntomas.
El laboratorio constituye, junto con las imágenes y la histología, el trípode que permite definir el diagnóstico y pronóstico de una hepatopatía por Virus C. A su vez el laboratorio cuenta con dos grandes grupos de ensayos: a-ensayos bioquímicos y b-ensayos virológicos.
Los ensayos virológicos son más específicos que las pruebas bioquímicas, y han sufrido modificaciones metodológicas con el fin de mejorar su sensibilidad y especificidad.

ENSAYOS VIROLOGICOS PARA DIAGNÓSTICO DE HCV
Serología:

Los ensayos para detección de anticuerpos anti HCV involucran dos grupos de determinaciones: 1- screening y 2- test suplementarios. Estos ensayos han evolucionado en los últimos 10 años mejorando significativamente su sensibilidad y especificidad
( Ver Fig. 1.)

El primer ensayo de screening para anti HCV fue licenciado por FDA (Food and Drug Administration) de Estados Unidos en 1990, y desde entonces se desarrollaron nuevas versiones para el uso en diagnóstico clínico y la búsqueda de anti HCV en pacientes asintomáticos. Las nuevas generaciones de ensayos de screening han disminuido la ventana serológica, observándose cambios con significación estadística en los distintos ensayos (Ver Fig. 2)
Actualmente se utilizan para screening los ensayos de 3ª generación que presentan una buena sensibilidad y especificidad. Sin embargo, estos ensayos pueden tener falsos positivos especialmente en poblaciones con baja prevalencia de HCV (<10%) como individuos asintomáticos sin datos clínicos, o personas que son estudiadas por primera vez por una probable infección por HCV, o en accidentes cortopunzantes.
La FDA tiene aprobado para el screening de anti HCV, dos inmunoensayos (EIA) (Abbot HCV 2.0 Abbott Laboratories y Ortho HCV 3.0 Elisa de Ortho Clinical Diagnostic) y un ensayo automatizado con detección por Quimioluminiscencia mejorada (VITROS anti HCV assay, Ortho Clinical Diagnostic) y recientemente en febrero de 2004 la FDA aprobó Axsym HCV 3.0 también para el screening diagnóstico de Hepatitis C.
La especificidad de estos ensayos es >/= 99%, sin embargo como mencionamos en poblaciones de baja prevalencia los falsos positivos pueden tener una media de 35% (rango de 15-60%), mientras que en individuos con inmunocompromiso puede llegar hasta un 15%.
Por esta razón los anti HCV positivos deben confirmarse con un ensayo de mayor especialidad: un test suplementario.
Son múltiples las razones por la que un laboratorio de Análisis Clínicos no cuenta con ensayos suplementarios para confirmar el resultado del test de screening: por no disponer de un estándar de laboratorio, por la dificultad de interpretación de estos ensayos y el alto costo de los test suplementarios. Por ello el CDC (Center For Disease Control of USA) ha propuesto un algoritmo diagnóstico de HCV incorporando el uso de la señal de los ensayos de screening (S/Co: Sample/Cut off) que han sido aprobados por FDA con excepción de Axsym HCV 3.0; con el fin de minimizar la cantidad de muestras que requieran un test suplementario (Ver Fig. 3).
De esta forma el 95% de las muestras de pacientes con una señal de anti HCV >/= 3.8 en los ensayos EIA 2.0 HCV Abbott y Ortho HCV 3.0 ELISA, tienen chance de ser RIBA 3.0 positivas de acuerdo a lo publicado por el CDC. Esto fue demostrado en distintos grupos poblacionales como: hemodializados, grupos con factores de riesgo, estudiantes, trabajadores de la salud. De igual modo el 95-98% de las muestras positivas en distintos grupos poblacionales, por el Ensayo Vitros anti HCV con una señal >/= 8.0 serán positivas por RIBA 3.0. Ver (Fig. 4).
Es importante reconocer que todos los datos se han evaluado con los ensayos aprobados por FDA para la detección de anti HCV excepto Axsym HCV 3.0, sin embargo en nuestro país existen diversos ensayos aprobados por el ente regulador que se comercializan para el screening diagnóstico de HCV.
Por ello es fundamental conocer no sólo su sensibilidad sino también su reactividad no específica, a los fines de tener la mayor certeza en la pesquisa diagnóstica. El control de calidad interno y externo de dichas determinaciones es prioritario, a la vez que todos los ensayos deben validarse bajo una determinada norma de calidad. La validación de estos ensayos involucra en casi todos, la comprobación de los datos de sensibilidad, especificidad, linealidad, valor de corte, reproducibilidad y robustez que asegura el fabricante del kit comercial en el inserto. La validación puede realizarse con estándares internacionales, con paneles comerciales de seroconversión que son muy costosos, o bien puede realizarse en muestras clínicas que cumplan con los requisitos para incluirse en el proceso de validación.

ENSAYOS SUPLEMENTARIOS

El RIBA 3.0 Chiron SIA para HCV aprobado por FDA como test suplementario es un ensayo que incorpora como epitopes antigénicos, péptidos sintéticos y recombinantes. Tiene una sensibilidad inferior a los ensayos de 3ª generación para anticuerpos anti HCV pero una mayor especificidad. Existe para diagnóstico también otro ensayo el INNO LIA HCV Ab III que puede utilizarse como suplementario similar al RIBA 3.0 HCV en sensibilidad pero con una mayor especificidad en algunas poblaciones evaluadas dado que sus epitopes antigénicos son péptidos sintéticos.
La tecnología de Ácidos Nucleicos (NATs: Nucleic Acid Technologies) se incorpora al diagnóstico de HCV como test suplementario que confirma la infección por HCV. Estos ensayos poseen una alta sensibilidad y especificidad y amplifican un segmento correspondiente a una región altamente conservada del virus (Por ej.: la región 5’ UT). Los formatos y diseños de estos ensayos son múltiples sin embargo los aprobados por FDA son kits comerciales: Amplicor HCV, Versión 2.0 y Cobas Amplicor HCV, versión 2.0 (Roche). Estos ensayos cualitativos y cuantitativos están validados con el primer Estándar Internacional HCV de la OMS (96/790), con un límite de detección de 50 Ul/mL. Sin embargo, existen otros métodos moleculares comerciales y artesanales (“in House”) que se utilizan para el diagnóstico de HCV. Todos estos ensayos moleculares deben ser validos con el Estándar Internacional de HCV. De igual modo, en estos ensayos moleculares debe definirse la sensibilidad (limite de detección y/o cuantificación) y especificidad, tanto analítica como clínica.

CONSENSO DIAGNOSTICO VIROLOGICO DE HCV

En nuestro país se han realizado dos reuniones consenso para Hepatitis C organizadas por la Asociación Argentina para el Estudio de las Enfermedades del Hígado (AAEEH) en el año 2000 y recientemente en el 2004. En esta última reunión consenso quedaron claramente definidas las pruebas diagnósticas virológicas de HCV y su interpretación:

• Detección de Anticuerpos anti HCV por ELISA de 3ª generación: detecta anticuerpos de Clase IgG.
* El informe de este ensayo debe indicar la relación de positividad (S/Co)

• Detección de Anticuerpos anti HCV por RIBA o LIA: método suplementario de uso limitado.
* Confirma un ELISA de baja relación de positividad o ELISA positivos con viremia no detectable.
* Un RIBA-LIA positivo con al menos dos determinaciones de HCV RNA no detectables, espaciadas en un lapso mínimo de 6 meses, sugiere fuertemente una infección resuelta.

• Detección cualitativa de HCV RNA: detecta viremia.
* Confirma el diagnóstico de Hepatitis C.
* Única prueba que hace diagnóstico de Hepatitis C aguda, con anti HCV negativo.
* Sirve para descartar sangre y/o hemoderivados infectados por HCV
* Evalúa la respuesta virológica al tratamiento antiviral

• Detección Cuantitativa de HCV RNA: cuantifica la viremia
* Determina el valor basal pre-tratamiento en pacientes con genotipo 1 y 4
* Se utiliza par evaluar intra-tratamiento la respuesta total en pacientes con genotipo 1 y 4

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