El Comité de Redacción de Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana ha seleccionado este artículo publicado en Informe ALAC. Ciencia y Ética, Nº 1, 2002, para su difusión a través de FABA-Informa. La autoría corresponde a Carole Spencer Ph. D., F.A.C.B. (Profesora de Medicina - University of Southern California, EEUU y la traducción y posterior revisión fue realizada por el Dr. Gustavo Maccallini)

Parte I

1. Introducción:

Esta presentación definirá las características técnicas óptimas necesarias para alcanzar la máxima utilidad clínica de las mediciones de TSH y Tg - dos de los tests más críticos y necesarios para el endocrinólogo. Para ilustrar diferentes puntos, se usará parte de las guías consenso "Laboratory Support for the Diagnosis and Monitoring of Thyroid Disease" de la National Academy of Clinical Biochemistry (NACB) de los Estados Unidos. Una versión completa de la misma se encuentra disponible en http://www.nacb.org

La medición de TSH y Tg comparten un número de características técnicas:

• Ambos analitos son glicoproteínas que están presentes en la sangre como isoformas heterogéneas.
• Ambos analitos fueron medidos primero por métodos de Radioinmunoensayo (RlA) hace más de 25 años, y ahora son medidos fundamentalmente por métodos inmunométricos (IMA).
• Ambas mediciones presentan todavía limitaciones de sensibilidad y especificidad que impactan negativamente sobre su utilidad clínica óptima.

2. Ensayo Inmunométrico (IMA) o Metodología tipo sandwich

Desde mediados de 1980, la metodología de ensayos inmunométricos (IMA) ha reemplazado progresivamente los antiguos métodos de radioinmunoensayos competitivos (RIA) utilizados para medir la mayoría de las proteínas en fluídos biológicos. La ventaja principal de los métodos IMA (Fig.1), comparados con los métodos RIA, es su sensibilidad incrementada (5 a 10 veces más sensible), menores tiempos de incubación y mayor rango útil de trabajo.

Fig.1 Esquema del principio de los ensayos inmunométricos.

El advenimiento de la tecnología que emplea anticuerpos monoclonales (MAb), ha sido lo que fortaleció el desarrollo del IMA, ya que estos métodos trabajan con ?exceso de anticuerpo?. Requieren un exceso del anticuerpo único o mezcla de anticuerpos MAb unidos a un soporte sólido. Este anticuerpo monoclonal asociado a la fase sólida "capta" el analito de la muestra de suero mientras un anticuerpo monoclonal o policlonal (Pab) diferente, marcado con una señal (isótopo, enzima, fluoróforo, molécula quimioluminiscente o bioluminiscente), se une a un epitope (s) diferente del analito. Durante un período de incubación de 0,5 - 24 horas (dependiendo del tipo de ensayo) las moléculas del analito en el suero se unen tanto al anticuerpo de captura como al asociado a la señal para formar un sandwich (Anticuerpo de captura-Analito-Anticuerpo señal). Después de lavar el soporte sólido, existe una relación lineal entre la señal unida al soporte sólido y la concentración sérica del analito. Una relación lineal entre las concentraciones de analito en los standards y la señal unida al soporte sólido forma la curva de calibración, base contra las cuales se cuantifican las muestras de concentración desconocida.

3. Limitaciones de la Metodología de Ensayos Inmunométricos (IMA)

a) Problemas Hook

Los ensayos de marcadores tumorales, basados en la metodología IMA, pueden tener un problema llamado hooking o de enganche. Como fuera descripto anteriormente, la cantidad de anticuerpo monoclonal unido al soporte sólido de un IMA tiene que estar en exceso, es decir, en cantidad suficiente para unir todo el analito presente en la muestra de suero. En condiciones donde los tumores producen grandes cantidades de analito por un lado, la concentración del anticuerpo de captura puede ser inadecuada y por otro lado la formación de los sandwich ser insuficiente y el resultado es una disminución en la curva de respuesta lineal, resultando en un valor inapropiadamente bajo, como se muestra en la Fig. 2.

Fig.2 Efecto Hook. Acción de altos niveles de analitos sobre los métodos inmunométricos.

Los problemas Hook no son encontrados en los métodos IMA para TSH, porque la máxima concentración de TSH observada en los pacientes hipotiroideos más severos (aproximadamente 1000 mUI/L) es sólo alrededor de 10 veces mayor que entre el límite superior del rango reportable (aproximadamente 100 mUI/L). En contraste, Tg es una molécula mucho más grande y en algunos pacientes con Carcinoma Diferenciado de Tiroides (CDT) pueden encontrarse concentraciones que son más de 100 veces mayores que el límite superior del rango reportable. Esto hace que los métodos de Tg estén sujetos a los problemas Hook.

Los fabricantes adoptan diversas estrategias para eliminar este problema:

Una consiste en lavar el soporte sólido después de la primera incubación del anticuerpo monoclonal de captura con la muestra de suero antes de la adición del anticuerpo asociado a la señal (técnica de 2 etapas).

Alternativamente pueden hacerse dos diluciones de cada suero para detectar un problema Hook y observar la presencia de discordancias entre las diluciones.

b) Limitaciones de Especificidad

Dado que los anticuerpos de captura tienen que estar presentes sobre el soporte sólido en una cantidad en exceso, se usan los Anticuerpos del tipo Monoclonal porque éstos pueden producirse en cantidades ilimitadas. Sin embargo, los mismos tienen limitado reconocimiento de epitopes. Cuando el analito en el suero es heterogéneo, tal como en el caso de las hormonas glicoproteicas hipofisarias así como también Tg, existe una posibilidad de que el anticuerpo de captura sólo reconozca un número limitado de las isoformas del analito en la muestra de suero. Otros métodos que usan un anticuerpo monoclonal diferente reconocen una selección diferente de isoformas. Las isoformas que son reconocidas pueden no ser necesariamente biológicamente activas. Tales discordancias entre actividad inmunológica y biológica se observan en la medición de TSH en el hipotirodismo central donde son secretadas isoformas inmunoreactivas pero biológicamente inactivas. Este problema de reconocimiento selectivo puede llevar a diferencias entre las mediciones hechas con distintos métodos que, a pesar de estar estandarizados contra Preparaciones Internacionales de Referencia, usan Anticuerpos Monoclonales de captura diferentes y producen resultados distintos (un problema visto tanto en los métodos para medir TSH como Tg).

Los estándares usados para TSH y Tg tienen que ser diluídos en una matriz de suero humano desprovisto de estos analitos. Desafortunadamente es virtualmente imposible para los fabricantes obtener cantidades suficientes de suero de tales características. En el caso de Tg, además existe la necesidad adicional de que la matriz sea libre de anticuerpos Anti Tg que están presentes en alrededor del 20% de los sueros de los pacientes con CDT. Los fabricantes resuelven típicamente este problema seleccionando una matriz proteica que ellos creen dará un valor cero que es similar a los sueros humanos libres de analito. Desafortunadamente estas matrices son frecuentemente lejanas a lo ideal y pueden producir desvíos (bias) entre las mediciones de standard y la de los sueros de los pacientes. La selección de una matriz subóptima también introduce diferencias entre los métodos y reduce la sensibilidad. Esta es la principal limitación de los métodos disponibles para Tg que muestran diferencias entre métodos muy grandes, de modo que las mediciones seriadas de un paciente no pueden ser hechas por métodos diferentes (Fig. 3).

Fig.3 Diferencias entre 10 métodos para medir Tg en 20 sueros con Anti Tg negativos (Rango 28D). Los métodos 2, 4, 5, 6, 7, 8 y 10 se encuentran estandarizados contra la Preparación IRPCRM-457. Sombreado demarca el límite de sensibilidad reportado por el fabricante.

c) Determinaciones de Sensibilidad

La sensibilidad es el parámetro que ha sido usado para definir la "calidad" de un ensayo de TSH .

Igualmente, ahora es aparente que es necesaria mayor sensibilidad para la medición de Tg sérica. Además, podría ser abandonado el uso de la prueba de estimulación con TSH Recombinante humana (TSHrh) -que ha sido introducida recientemente para aumentar la sensibilidad de la determinación de Tg cuando la Tg sérica es no detectable durante la terapia supresiva con L-T4- (en forma análoga a la respuesta de TSH al TRH para valores bajos), si los ensayos de Tg sérica fueran entre 10 y 100 veces más sensibles.

Debido a que la Sensibilidad es una marca reconocida de la performance de un ensayo, los fabricantes son proclives a sobre estimar la sensibilidad puesta para sus ensayos. La comunidad científica ha aceptado ahora algunos conceptos fundamentales para establecer un parámetro de sensibilidad clínicamente relevante para determinar el menor límite de detección para la determinación de TSH. Estos conceptos pueden ser aplicados a la medición de Tg y ser adaptados a otros analitos. Estos conceptos se basan en una apreciación de la diferencia entre Sensibilidad "Analítica" y "Funcional".

? Sensibilidad Analítica (Parámetro Intra ensayo)

Los fabricantes son proclives a citar en sus instructivos la sensibilidad analítica porque este cálculo provee los estimados más optimistas de sensibilidad.

La sensibilidad analítica se calcula de la precisión de 20 replicados en un ensayo de la matriz cero, que claramente no se relacionaría con la sensibilidad potencial del test en la práctica clínica.

Específicamente, en las muestras de la práctica clínica se miden de un modo inter ensayos de modo que las muestras seriadas de un paciente pueden ser usadas para determinar la eficacia de la terapia. Estas muestras pueden ser analizadas en diferentes ensayos hechos en términos de semanas para TSH o meses a años diferentes para Tg.

Cuanto mayor es el período entre análisis, en mayor medida es probable que la medida de la precisión del test se debilite debido a la variabilidad entre lotes de los reactivos, diferencias en la performance del instrumento, diferencias en el operador y una serie de otros factores pobremente identificados.

? Sensibilidad Funcional (Parámetro Inter Ensayo)

Ha sido aceptado que la Sensibilidad Funcional es el parámetro más apropiado para establecer el límite de detección inferior de TSH y de otros analitos. Las Guías C2 y C3 de NACB definen la sensibilidad funcional para TSH y cómo debería ser establecida por el laboratorio.

Específicamente, la sensibilidad funcional debería ser establecida usando una mezcla de suero humano con un valor de TSH asignado de alrededor del 10% por sobre el límite de detección esperado. Los ensayos deberían ser realizados en un período de 6 - 8 semanas, ya que representa el intervalo clínico típico para la evaluación seriada de mediciones de TSH en pacientes ambulatorios.

Guía C2: Definición de Sensibilidad Funcional

1.Para determinar el Límite de Detección del ensayo debería usarse el cálculo de la Sensibilidad Funcional.

2.La sensibilidad Funcional del ensayo de TSH corresponde al valor de la hormona que coincide con el 20% del coeficiente de variación inter ensayo establecido por el protocolo recomendado (ver Guía C3).

Conceptos de Sensibilidad funcional y Precisión aplicables a la medición de Tg sérica.

La sensibilidad funcional y la precisión inter ensayo de un ensayo de Tg deberían ser establecidas usando una modificación de la Guía C3 de NACB.

Guía C3: Protocolo para Determinar la Sensibilidad Funcional y la Precisión Inter ensayo

Medir las mezclas de suero humano que cubran el rango del ensayo en al menos 10 ensayos diferentes. El valor de la mezcla con el valor más bajo debería estar un 10% por encima del límite de detección y el valor de la mezcla más alta debería estar en un 90% del valor del límite superior del ensayo.

• Debería ser ensayado el efecto de arrastre (carry-over) analizando la mezcla del valor más alto seguido por la mezcla del valor más bajo.
• Usar el mismo modo de ensayo que el utilizado para las muestras de pacientes (es decir, simplificado o duplicado).
• El operador del instrumento no debería conocer la presencia de las mezclas en el ensayo.
• Los ensayos deberían ser repetidos sobre un intervalo clínicamente representativo (es decir 6 a 8 semanas para TSH en pacientes ambulatorios).
• Usar al menos dos lotes de reactivos diferentes y dos calibraciones del instrumento diferentes durante el período de estudio.

Claramente, para la relevancia clínica, la principal diferencia del protocolo de TSH es la necesidad de usar mezclas de suero humano libre de Anticuerpos Anti Tg. Es también crítica la extensión del tiempo en el cual son analizadas las mezclas para que sean más representativas de las mediciones de Tg seriadas hechas para controlar los pacientes con CDT. Específicamente, se requiere un período de 6 - 12 meses más que las 6 - 8 semanas recomendadas para TSH, porque, como se muestra en la Fig. 4, existe una pérdida significativa de la precisión cuando la medición de Tg se hace sobre este tiempo más extendido, que es un tiempo clínicamente relevante. Adicionalmente, las matrices de suero no humano utilizadas por los fabricantes exhiben típicamente mejor precisión entre ensayos que un suero humano con un valor de Tg igualmente bajo. La sensibilidad funcional establecida usando tales matrices tiende a ser sobre óptima.

Fig.4 Disminución de la precisión entre ensayos para Tg a lo largo del tiempo usando matrices de suero humano (H) y no humano (N)

La sensibilidad de los métodos de Tg disponibles es sub óptima. Todos los sueros normales tendrían una concentración de Tg detectable. Esto no siempre se cumple como se muestra en la Fig. 3, donde dos métodos fallaron en detectar Tg en dos sueros normales (paréntesis). Usando las mejoras en la sensibilidad de TSH como una referencia, es probable que la sensibilidad de los métodos usuales de Tg sea análoga a los métodos de primera generación de TSH, y que debería ser óptimo un mejoramiento en la sensibilidad de 100 veces.

d) Consideraciones de la Especificidad.

La adopción de la metodología IMA que emplea anticuerpos monoclonales, tiene en general un mejoramiento en la especificidad de la medición para la mayoría de los analitos proteicos. En el caso de la TSH, el desarrollo de métodos IMA que emplean anticuerpos monoclonales de captura con especificidad para la subunidad beta de TSH, ha eliminado virtualmente los problemas de la reacción cruzada que aparecían en los métodos RIA. Estos métodos RIA empleaban anticuerpos policlonales y sufrían típicamente de reacción cruzada con la subunidad alfa común de las otras hormonas glicoproteicas (LH, FSH y HCG).

Sin embargo, la especificidad restringida de un anticuerpo monoclonal puede ser un impedimento cuando se miden analitos tales como TSH y Tg que circulan como isoformas heterogéneas. Específicamente, el epitope reconocido por un anticuerpo monoclonal comprende típicamente sólo 6 aminoácidos. Estos aminoácidos pueden no ser necesariamente parte de una secuencia lineal en la estructura proteica, pero pueden ser conformacionales, es decir, discontínuos pero próximos debido a la conformación terciaria de la proteína. Así, las condiciones patológicas que cambian la conformación de la proteína, secundarias a cambios en la glicosilación (para TSH y Tg) o en la iodinación (para Tg), tienen el potencial de influir en la conformación molecular y así enmascarar o exponer epitopes que a su vez, pueden influir en la inmunoreactividad de la molécula.

Estos hechos de especificidad, probablemente explican la sorprendente magnitud de las diferencias entre los métodos de diferentes fabricantes para TSH y Tg, aún cuando el método sea estandarizado contra la misma preparación internacional de referencia. La utilidad clínica de las mediciones de TSH y Tg se ve afectada en forma negativa por las diferencias entre los métodos de modo diferente:

? Medición de TSH Sérica - Especificidad

La especificidad del anticuerpo de captura seleccionado para un método de TSH determina qué isoformas de TSH son detectadas por el ensayo. Es bien conocido que la glicosilación (especialmente el grado de sialización) de la molécula de TSH determina su clearance así como también su actividad biológica. También está bien establecido que situaciones fisio-patológicas influyen en la glicosilación molecular. Las mediciones de TSH séricas hechas en el Hipotiroidismo central (disfunción hipofisaria o hipotalámica) provee un claro ejemplo de discordancia entre bioactividad e imunoactividad. Específicamente, tales pacientes tienen hipotiroidismo clínico y pese a eso tienen TSH sérica en el rango normal o aún ligeramente elevada. Las moléculas de TSH aisladas del suero de tales pacientes muestran claramente glicosilación anormal y disminuída potencia biológica. En contraste, los pacientes con tumores hipofisarios pueden exhibir TSH con glicosilación anormal que aumenta la actividad biológica.

Todos los métodos de TSH están estandarizados contra la misma preparación de referencia internacional (MRC 80/558) pero están construídos usando diferentes anticuerpos monoclonales. Ya que diferentes anticuerpos monoclonales sobre el soporte sólido capturan diferentes isoformas de TSH de la muestra, existen diferencias entre métodos que usan anticuerpos monoclonales de captura diferentes. Como se muestra en la Fig. 5, esto afecta principalmente el límite de referencia superior y así el valor de corte que se debería usar para definir el hipotiroidismo leve (subclínico).

Fig.5 Rangos de referencia para 12 ensayos inmunométricos de TSH.

? Medición de Tg Sérica. Especificidad

Para la medición de Tg sérica, que se usa principalmente para el seguimiento a largo plazo de pacientes con CDT, los diferentes métodos de Tg exhiben una diferencia de 3 veces de magnitud, a pesar de la estandarización contra la Preparación de Referencia Internacional CRM-457 (Figura 3). Esta variabilidad inter-método impide el uso de métodos diferentes de Tg para el control seriado de los pacientes con CDT.

e) Interferencias:

Las interferencias en las mediciones con IMA pueden producir señales falsamente elevadas o disminuídas, resultando en valores falsamente altos o bajos respectivamente.

Una interferencia puede ser no específica, es decir producto de sustancias que no tienen similitud física con el analito (Anticuerpos Heterófilos - HAMA) que afectan a los métodos para medir TSH o Tg (Estos anticuerpos son de origen humano y están dirigidos contra las inmunoglobulinas animales de los reactivos, mimetizando la acción del analito), o pueden ser un anticuerpo contra el analito mismo (Anti Tg afectando la medición de Tg).

Alternativamente, las interferencias se pueden deber a la presencia de sustancias en la muestra que tienen similitud inmunológica o física al analito (prohormonas, isoformas o fragmentos del analito).