Lic. Dra. Ana María Pertierra
Colaboradora

En los últimos años, el diagnóstico clínico ha experimentado profundas modificaciones debidas, en gran medida, a los avances producidos en diferentes áreas de la Biomedicina, de las que se destacan la biología celular y la genética molecular. Estos avances científicos han contribuido al mejor conocimiento de la etiopatogenia y la fisiopatología de muchas enfermedades, dependiendo en cierto modo del desarrollo concomitante de nuevos métodos cuantitativos de análisis celular. De entre ellos se destaca la citometría de flujo por la relevancia que esta tecnología ha alcanzado, tanto en la investigación básica como en el diagnóstico clínico.

La citometría de flujo constituye un complemento valioso de las técnicas clásicas utilizadas para el estudio de la morfología, de la biología y de la bioquímica celular.

La citometría del flujo, por su carácter multidisciplinario, se ha beneficiado de los avances producidos en áreas tan diversas como la tecnología láser, la química de los compuestos fluorescentes, las técnicas de tinción histoquímica, la producción de anticuerpos monoclonales, la óptica, la electrónica y la informática.

Esta tecnología permite analizar de forma simultánea diversas características celulares, lo que proporciona información de un gran número de parámetros de cada una de las células que se analizan, identificando en una muestra subpoblaciones de células diferentes, incluso cuando están escasamente representadas.

El principio en el que se basa la citometría de flujo es simple. Consiste en hacer pasar células u otras partículas en suspensión (núcleos, cromosomas, mitocondrias, etc.), previamente tratadas con anticuerpos monoclonales específicos marcados con fluorocromos, alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso. La interacción de las células o partículas con el rayo luminoso genera señales que se llevan a los detectores adecuados. La información producida surge del análisis de la dispersión de la luz por un lado y de la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o partícula al ser excitado por el rayo luminoso, por el otro. Las señales luminosas detectadas se transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales que se procesan por el ordenador.

Esta tecnología ha encontrado gran utilidad en ciencias como la inmunología, la hematología, la oncología, la anatomía patológica y la biología celular. Mediante la citometría de flujo son posibles los estudios del ciclo celular, el análisis de antígenos celulares, la determinación de la ploidía en cánceres y los estudios de diversos parámetros celulares como la concentración del Ca++ intracelular, el pH intracelular, la apoptosis y la incorporación de análogos de la timidina.

El uso de anticuerpos monoclonales ha provisto a la técnica de reactivos inmunológicos muy específicos para clasificar y estudiar células. Al mismo tiempo, la introducción de nuevos compuestos fluorescentes para el marcaje ha permitido la medida simultánea de varias características celulares.

Es de destacar el aporte de la citometría del flujo al estudio de las subpoblaciones linfocitarias en distintas patologías y al diagnóstico y clasificación inmunológica de leucemias y linfomas.

Estudio de Subpoblaciones Linfocitarias

El sistema inmune de cada individuo se comporta según el número y estado funcional de los diferentes subtipos de linfocitos circulantes. Su estudio tiene un importante valor en el diagnóstico y seguimiento de terapias inmunosupresoras e inmunorrestauradoras en determinadas situaciones clínicas, así como en las inmunodeficiencias, en las enfermedades autoinmunes, en la patología infecciosa, en el estudio de las neoplasias y en el trasplante de médula ósea y de otros órganos.

De las diferentes aplicaciones de la citometría de flujo a nivel clínico la más difundida es la determinación de antígenos celulares, moléculas presentes en las células a las que se unen anticuerpos dirigidos específicamente contra ellas. El marcaje simultáneo de diferentes antígenos celulares ha permitido obtener importantes avances médicos en lo que se refiere al estudio de subpoblaciones linfocitarias (linfocitos T, linfocitos B y Natural Killers).
En situaciones clínicas en las que se sabe que varían las proporciones normales de las distintas poblaciones linfocitarias tal como en individuos HIV+, en leucemias, linfomas, infecciones y enfermedades autoinmunes, la citometría de flujo representa un método rápido, objetivo y cuantitativo de análisis. Del mismo modo, el empleo de esta tecnología ha demostrado ser de gran utilidad en el diagnóstico de trombocitopenias adquiridas, en la detección de autoanticuerpos, inmunocomplejos, oncoproteínas, receptores celulares para factores de crecimiento y hormonas, etc.

Una de las aplicaciones más habituales es el seguimiento de los pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (HIV). En personas sanas el cociente entre el número de linfocitos T y CD4 y linfocitos T y CD8 varía entre 1,1 y 4. En cambio en pacientes con SIDA dicho cociente se encuentra por debajo de 1, debido a un significativo descenso de las células CD4.

La cuantificación del número absoluto de linfocitos T CD4+ posee en los pacientes infectados con el virus HIV valor diagnóstico y pronóstico. En este sentido, su descenso se ha relacionado con diferentes fases de la enfermedad, como el momento de la seroconversión, el de la aparición del SIDA y el de la evolución final. Durante el período asintomático que sigue generalmente a la seroconversión, el nivel de las células TCD4+ se mantiene prácticamente estable. Y va disminuyendo gradualmente con el aumento de la severidad de la enfermedad.

Consultada la doctora Alicia Delgado Caffé, bioquímica jefa de la Sección Serología del Laboratorio Central del Hospital de Niños Sor María Ludovica de La Plata, comenta: "Fue un cambio total introducir el citómetro de flujo, debido a que es un método más exacto y más rápido comparado con el de fluorescencia que utilizábamos antes. Se podría decir que las poblaciones linfocitarias y los HIV con el uso de esta tecnología están mucho mejor estudiados".

Inmunofenotipo en Leucemias y Linfomas

En la actualidad el diagnóstico y clasificación de las leucemias y los linfomas se sigue basando en criterios morfológicos y citoquímicos. El análisis mediante citometría de flujo junto con el enorme catálogo de anticuerpos monoclonales del que se dispone representa una herramienta fundamental para delinear la diferenciación de las células hematopoyéticas normales y como consecuencia ha llevado a clasificar las neoplasias derivadas de éstas células de acuerdo con la ontogenia de las células hematopoyéticas.

Además, para el seguimiento terapéutico de las hemopatías malignas la citometría clínica representa uno de los retos más importantes. Tal es el caso de la detección de enfermedad mínima residual donde se requiere identificar las células neoplásicas de forma específica como distintas de las células normales, incluso cuando estén presentes con frecuencias extraordinariamente bajas.

"Trabajando con distintos anticuerpos monoclonales se puede establecer el linaje de las células en estudio. La inmunotipificación a través de los histogramas que arroja la citometría del flujo orienta al médico en la clasificación de los distintos tipos de leucemia", agrega la doctora Delgado Caffé.

"Si bien la citometría de flujo representa una ayuda diagnóstica muy importante, no hay que dejar de lado que la técnica requiere de un operador muy bien entrenado" concluye la doctora Delgado Caffé.

En estos días visita nuestro país el doctor Alberto Orfao, jefe del Servicio de Hematología y Servicio General de Citometría del Hospital Universitario de Salamanca, España, y participará en el III Congreso de Bioquímica de Buenos Aires. Allí presentará las últimas novedades respecto a esta técnica que representa hoy en día toda una especialidad.